转化率的计算.ppt

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1、第二节重组体导入受体细胞的原理与技术一、重组DNA导入大肠杆菌的方法二、重组DNA导入真核细胞的方法三、转化率及影响因素一、重组DNA导入大肠杆菌的方法相关概念1.转化(transformation)细菌获得外源质粒DNA，产生新的遗传性状的过程。2.转导(transduction)以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程。3.转染(transfection)指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子的过程。转导和转染的区别转导：通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA转移到受体细胞的过程。转染：λ噬菌体DNA分子直接

2、导入受体细胞的过程。（一）转化（transformation）（1）热激法（heatshock）（2）电转化法（electronporation）（3）PEG介导的原生质体转化（4）接合转化一、重组DNA导入大肠杆菌的方法1、化学转化法感受态：细菌能从周围环境中吸收DNA的生理状态称为感受态(competence).感受态的出现是由于细菌表面出现许多DNA结合位点，这些位点只能与双链DNA结合，而不与单链DNA结合。这说明完整的双链结构对于转化活性来说是必要的。对于大肠杆菌细胞，一般采用CaCl2溶液来处理受体细胞，增加细胞膜的通透性，制备感受态细胞

3、。一、重组DNA导入大肠杆菌的方法一、重组DNA导入大肠杆菌的方法细菌感受态细胞的制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬一、重组DNA导入大肠杆菌的方法重组体导入受体细胞10ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置30分钟37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA加入1mLLB培养基42ºC1.5分钟热休克法简

4、单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。一、重组DNA导入大肠杆菌的方法平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜一、重组DNA导入大肠杆菌的方法2.电击转化法将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内原理:用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞.转化效率高（高于109/gDNA）一、重组DNA导入大肠杆菌的方法LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6

5、冰浴15分钟，2℃离心集菌冰冷的水重悬菌体2℃离心集菌冰冷的水重悬菌体2℃离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L电转仪调为2.5kV,25F脉冲控制器200-4000.5g质粒DNAOnice混合加入1mLSOC培养液37℃中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化电击转化法（二）转　导由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程（三）转　染噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接被感受态细胞捕获的过程。与转化无本质区别体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。每gDNA能形成106个噬菌斑现在把DNA转移至

6、动物细胞的过程也称转染体外包装过程二、重组DNA导入真核细胞（一）导入酵母细胞原生质体转化碱金属离子介导的完整细胞转化PEG1000转化法电击法（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞1.利用原生质体进行转化酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2PEG插入外源基因的载体转化转化细胞达原生质体总数的1%~2%，转化率受再生率影响共转化的原生质体占转化子总数的25%~33%酵母0.1mol/LLiCl处理感受态2.碱金属离子介导的完整细胞转化插入外源基因的载体40%PEG4000热激涂布选择性平板，筛选转化子吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍转

7、化率：103个/gDNA；共转化现象极少4.电击转化（1）适于原生质体和完整细胞（2）转化率高，105个/gDNA（3）单链转化率高于双链3.PEG1000转化PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化二、重组DNA导入真核细胞（一）导入酵母细胞载体介导的转化（农杆菌介导）DNA直接导入（基因抢法、电击法等）种质系统法（花粉管通道法等）（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将重组DNA转入含

8、有Vir致病基因的农杆菌（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法通过农杆菌侵染植物外植体（二）