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1、青藤碱抗炎抗风湿作用机理研究作者：李晓娟，王培训，刘良，王文君，周联,梁瑞燕，曹柳英【关键词】青藤碱摘要：【目的】研究青藤碱抗炎、抗风湿作用机理。【方法】采用小鼠巨噬细胞株J774体外培养，观察药物对该细胞株增殖、一氧化氮(NO)合成以及肿瘤坏死因子a信使核糖核酸(TNFamRNA)表达及生物合成的影响。【结果】青藤碱能够抑制该细胞株增殖，抑制脂多糖(IPS)刺激状态下的NO合成；对TNFc(蛋白合成具有抑制作用，但仅在高浓度时才对TNFamRNA表达具有轻微的抑制作用。【结论】青藤碱可能通过下调单核/巨噬细
2、胞系统炎症介质和细胞因子合成发挥抗炎、抗风湿作用。关键词：关节炎，类风湿/中药疗法；青藤碱/药理学；细胞，培养的；一氧化氮；肿瘤坏死因子青藤碱(sinomenine)是从屮药青风藤屮提取的一种单体牛物碱，具有抗炎、抗风湿、免疫抑制、镇痛、镇静等多方面的药理作用［1］,临床用于治疗类风湿性关节炎(RA)等口身免疫性疾病疗效较好，且副作用小［2］。巨噬细胞在RA等自身免疫性疾病的发病中具有重要作用，有研究认为凡是对RA有效的治疗方法或药物均能下调单核/巨噬细胞系统的功能［3］。因此，我们选择了具有正常巨噬细胞显著
3、特征的J774巨噬细胞株［4］,观察该药对其生长及炎症介质基因表达和生物合成的影响。1材料与方法11材料111J774巨噬细胞株引自第一军医大学自由基教研室，来源于AmericanTypeCultureCollect!on(ATCC,美国)。细胞采用含体积分数为10%的胎牛血清的RPMT1640培养液(含青霉素、链霉素各1000U・L-1)传代培养，选择对数生长期的传代培养细胞用于实验。112主要试剂青藤碱纯品(原料药)由湖南正清制药公司提供；消炎痛(indomethacin)纯品，美国Caym
4、an公司；胎牛血清，杭州四季青产品；RPMI1640、DMEM培养基,美国GIBC0公司；一氧化氮(NO)检测试剂盒和小鼠肿瘤坏死因子a(TNFa)检测试剂盒，深圳晶美生物工程有限公司；总核糖核酸(RNA)提取试剂盒和逆转录聚合酚链反应(AccessRTPCR)试剂盒,Promega公司;脂多糖(LPS)和卩塞哩蓝(MTT),Sigma公司；其他试剂为国产分析纯。12方法121青藤碱对J774细胞增殖的影响采用MTT法检测，方法参照文献［5,6］。122青藤碱对J774细胞株合成NO、TNFa的影响细胞采用含
5、体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液培养，调整细胞浓度为1X109/L,加500»L入24孔板，贴壁3h后，每孔加含不同浓度青藤碱的培养液500HL,LPS10uL(终浓度10mg/L),继续培养24h,收集上清液，20°C保存。按N0试剂盒(酶法)说明进行检测,cN0(umol/L)=D测定管/D标准管X100umol/L；按TNFci检测试剂盒(ELISA法)说明检测TNFa浓度值(ng/L)o123细胞总RNA的提取调整细胞浓度为1X109/L,每孔加2皿入6孔细胞培养板，贴壁2h后加LPS和不同浓
6、度的青藤碱(LPS终浓度为10mg/L),继续培养4h后提取细胞总RNA(操作按试剂盒说明进行)o124TNFuinRMA表达的检测采用RTPCR法[7],引物由上海生物工程公司合成，TNFa的引物为:5AGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAA3(Sense),5ACACCCATTCCCTTCACAGAGCAAT3(Antisense)(446bp)o以Pactin作为内参。取8uLRTPCR扩增反应产物+2uL澳酚蓝加样缓冲液,15g/L琼脂糖电泳lh,澳乙锭(EB)染色30min后，UVP凝胶摄
7、相仪照相分析结果。2结果21青藤碱对J774细胞增殖的影响青藤碱和消炎痛对J774细胞株细胞增殖均具有显著的抑制作用，其半数抑制药物浓度分别约为Imino1/L和0094iniiiol/L(图1)。从细胞增殖结果分析，其后的实验设计青藤碱的浓度均采用c^lmmol/LC低于或等于达到半数抑制率的药物浓度)。22青藤碱对J774细胞株一氧化氮(NO)合成的影响青藤碱作用24h能够抑制LPS刺激状态下J774细胞合成NO,其半数抑制药物浓度约在500-1000umol/L之间(图2)。23青藤碱对J774细胞株T
8、NFa蛋白合成的影响在625umol/L>500umol/L>lmmol/L浓度下,青藤碱能够显著抑制LPS刺激状态下TNFu蛋白合成,抑制率分别为2901%、4946%、9364%(图3)o24青藤碱对J774细胞株TNFamRNA基因表达的影响以LPS刺激J774细胞，培养2h,对TNFamRNA表达的刺激作用轻微。青藤碱lmmol/L对不加或加LPS刺激状态下TNFamRNA的表达具有轻微抑制
