蛋白相互作用酵母双杂交.pptx

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1、蛋白相互作用与酵母双杂交Protein-proteinInteraction&YeastTwo-hybrid黄宝玉2012.8.17Slide1报告内容：蛋白相互作用与研究方法酵母双杂交原理和方法酵母双杂交的发展已有实验的进展存在问题与下一步计划Slide2Protein-proteinInteraction蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。Slide3蛋白质相互作用研究技术Genetic

2、YeastTwo-hybridPhageDisplayMutationalanalysisBiochemicalImmunoprecipitation(IP)Co-Immunoprecipitation(Co-IP)Pull-DownAssaysFarWesternChemicalCrosslinkingLabel-transferFeBABEmappingFluorescentImmunofluorescenceco-localizationFRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)Slide4Slide5噬菌体

3、展示技术的原理融合蛋白PIII基因型表达型噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体衣壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随衣壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。通过体外亲和（绑定）靶分子筛选到的噬菌体克隆经过下一轮扩增而富集。Slide6biotinantigenSolutionphaseselectionwithbiotinylatedantigenSlide7BindtoStreptavidincoatedmicrotitrewellsSlide8Washtoremoveunboundphagepa

4、rticles.Slide9EluteboundphageSlide10AmplifyelutedphageRepeatselectionAnalyzea)ELISAb)Specificityc)Sequencingd)Affinitye)ActivityE.coli感染和扩增Slide11Slide12Slide13RIGIExperimentalControl(GST-Fusion)(GST)GSTMAVSGSTGSTMAVSGSTWashSDS-PAGEGST沉降示意图GST-pulldown原理RIGIRIGISlide14Cross-linki

5、ngSlide15报告内容：蛋白相互作用与研究方法酵母双杂交原理和方法酵母双杂交的发展已有实验的进展存在问题与下一步计划Slide16酵母双杂交系统的功能Slide17酵母双杂交原理图酵母双杂交的简单介绍Slide18酵母双杂交系统的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterreportergenetranscriptionGAL4UASPromoterreportergeneGAL4UASPromoterreportergeneXDNA-BDSlide19(Fields&Song,1989)酵母双杂交系统:三个启动子，四个报告基因Sl

6、ide20三个启动子，四个报告基因HIS3.Whenbaitandpreyproteinsinteract,Gal4-responsiveHis3expressionpermitsthecelltobiosynthesizehistidineandgrowon–Hisminimalmedium.ADE2.Whentwoproteinsinteract,Ade2expressionisactivated,allowingthesecellstogrowon–Ademinimalmedium.AUR1-C.Adominantmutantversionofth

7、eAUR1genethatencodestheenzymeinositolphosphorylceramidesynthase.itsexpressionconfersstrongresistance(AbAr)totheotherwisehighlytoxicdrugAureobasidinA.MEL1.MEL-1encodesα-galactosidase.Asaresultoftwo-hybridinteractions,α-galactosidase(MEL1)isexpressedandsecretedbytheyeastcells.Yeast

8、coloniesthatexpressMel1turnblueinthepres