戊型肝炎病毒衣壳蛋白同源二聚体的相互作用结构域.pdf

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1、!"卷#期生物工程学报%&’(!")&(#!""$年#月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12*+,-+./!""$!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!戊型肝炎病毒衣壳蛋白同源二聚体的相互作用结构域李少伟何志强王颖彬陈毅歆刘如石林鉴顾颖张军夏宁邵"（厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室，厦门02#""7）摘要为了探讨戊型肝炎病毒衣壳蛋白同源二聚体形成的关键区域和相互作用结构域，以及二聚

2、体形成与主要天然中和表位的形成之间的关系，通过末端缺失、定点突变技术研究戊型肝炎病毒（C:%）DE4!的++08$1++2"2片段):!的聚合现象，发现其F端的++78G1++2"（!H%H%IH）疏水区是该片段同源聚合的核心区域，提高该区域氨基酸的亲水性将妨碍聚合现象的发生；半胱氨酸化学交联实验表明):!形成同源二聚体时，++78G在空间位置上相接近，处于可生成化学键的距离，提示所处区域为疏水聚合的作用结构域；通过J’+=K程序估算核心区域的天然突变率，发现其疏水性高度保守；)端缺失实验表明，至少27个

3、氨基酸既不影响同源聚合也不直接参与主要的天然中和表位的形成，但可协助中和表位构象的形成，而这种协助作用可被DE4!的末端肽段所代替。++78G1++2"!（H%H%IH）疏水区为戊肝病毒衣壳组装的第一步骤的核心区域，并与重要的天然中和表位的形成直接相关，从而为戊肝病毒疫苗的研究提供更详细的信息。关键词戊型肝炎病毒，DE4!，基因突变，同源聚合，作用结构域中图分类号L2#G文献标识码H文章编号#"""10"2（#!""$）"#1""8"1"8戊型肝炎病毒（C:%）是一种无包膜、二十面体!材料与方法对称结构的

4、E)H病毒，其基因组包含0个开放读码框架（DE4），其中DE4!编码22"个氨基酸的结构蛋!"!质粒与菌种白（MDE4!），组成病毒衣壳。在过去的研究中，我们含有C:%DE4!++08$1++2"2基因片段的非融合［0］［#］在大肠杆菌中表达了DE4!的++08$1++2"2的重组蛋表达载体N5D15G1:!及N5D15G为本实验室所构白（):!），发现其溶液可形成从二聚体到至少六聚建与保存，含有C:%DE4!++08$1++22"基因的质粒体的多种聚体，二聚体形式的多肽与戊型肝炎病人NO:P1!"51D

5、E4!Q#由香港大学吴文翰教授惠赐，受急性期和恢复期血清及中和单抗的反应性均显著优体菌3(0(,#:E!722购自)6R:,@’+,AJ<&’+S=公司。于其单体形式，提示其较好地模拟了衣壳蛋白组装!"#引物［#］成病毒衣壳时的结构状态。用该重组蛋白免疫恒根据N5D15G1:!上C:%DE4!基因序列，定点河猴，可以产生高效价的抗C:%抗体，并可保护免突变时，尽可能选用3(0(,#的嗜性密码子，由上海［$］疫猴在大剂量C:%攻击下仍不出现任何肝炎症状，博亚公司合成。:!基因两端的引物为：7T端引物提示):

6、!蛋白的折叠方式与C:%衣壳蛋白的天然C:4M（7T1B+K+K@B+@BK@KKBK+BKBKB@KB10T），0T端引物C:EM［!］折叠方式较为接近。):!形成的二聚体可被尿素（7T1BKB@+@+++K+++BK+K++BKBBB@+10T）。其它引物序列如或热处理所解聚，而且序列中不含半胱氨酸，不可能表#、表!和表0所示。形成二硫键，提示疏水相互作用对):!二聚体的形!"$工具酶及其它成具有关键作用。本研究通过疏水性分析、肽段末限制性核酸内切酶、4+5U)H聚合酶和NVU#31端缺失、氨基酸定点

7、突变、半胱氨酸的化学交联实验5载体为5+W+E+产品，酶标记抗体购自晶美公司，和生物信息学等手段，进一步研究):!蛋白二聚体为MED5DX产品，预染蛋白分子量标准和蓝染试剂形成的关键区域和发生同源聚合的作用结构域，以为C/F’&,6M<6.B6公司产品。及二聚体形成与主要免疫表位的形成之间的关系。收稿日期：!""01"21#!，修回日期：!""01"31##。基金项目：福建省科技重大项目（)&(!""!4"#0），教育部跨世纪优秀人才培养计划（!""!）。"通讯作者。56’：32178!1!#3$##"；

8、4+9：32178!1!#3$##"；:1;+<’：,=9<+>?<,@9<+,(9;-(6A-(B,1期李少伟等：戊型肝炎病毒衣壳蛋白同源二聚体的相互作用结构域41表!"#$%端缺失的引物粒#EO6E;6K（0图1）为模板，根据表1和表,所列引&’()*!&+*,-./*-012"#$%34*-/.5’)6*)*4.15物，其中3端缺失的8-端引物均与LKN!引物配对、!"#$%&"’()*$%(+,-!.%/".C端缺失的