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1、·110·中国实验血液学杂志JournalofExperimentalHematology2001;9(2)EPO受体介导白血病细胞系KOCL233细胞增殖信号转导11樊 华 杉田完尔 翟 明 中泽真平(中国医科大学第一临床学院血液科 沈阳 110001)摘要 检测白血病细胞系KOCL233EPO受体(EPOR)的表达并阐明EPOR介导的增殖信号的转导途径。用生物素酰基化EPO和流式细胞仪检测EPOR的表达,用免疫沉淀法和Western印迹法检测EPOR,SHC和PLC2γ的酪氨酸磷酸化。结果发现KOCL233细胞可有EPOR
2、的表达,且EPO可引起其增殖。EPO刺激后1分钟,EPOR形成同源二聚体,出现酪氨酸磷酸化;EPO刺激后1分钟,SHC和PLC2γ出现免疫共沉淀和酪氨酸磷酸化增强。上述结果说明在EPOR介导的KOCL233细胞增殖信号的传导中,EPOR形成同源二聚体、出现酪氨酸磷酸化,且SHC和PLC2γ两者结合在一起协同发挥作用的。关键词 红细胞生成素受体 KOCL233白血病细胞系 SHCPLC2γ 酪氨酸磷酸化 细胞增殖信号转导中国图书资料分类法分类号 R733.7R973 红细胞生成素(EPO)是分子量为35-40kD的化学发光(
3、ECL)试剂(AmershamLIFESCIENCE)。糖蛋白,为调节红细胞产生的最重要的细胞因子。表1为实验所用抗体。EPO通过幼红细胞表面的红细胞生成素受体方法(EPOR)来促进红系的增殖和分化。EPOR的结构荧光染色法 用此方法将荧光物质结合到细胞现已明确,为无酪氨酸激酶活性的细胞因子受体超系上,再用流式细胞仪检测EPOR的表达。此方法[1]家族的一员。在EPOR介导下,一系列信号传递为:①按照参考文献[1]制备生物素酰基化EPO。5蛋白被磷酸化,将信息传导到细胞核。我们选择了②将制备好的生物素酰基化EPO20U与5×10对EPO
4、刺激有显著扩增的来源于急性淋巴细胞白KOCL233细胞4℃孵育60分钟,冷PBS洗3次。血病的细胞系KOCL233进行了有关信号传导蛋白③加2μlPE2Avidin于4℃孵育30分钟,再用冷的酪氨酸磷酸化的检测,探讨了含SH2的转化蛋白PBS洗2次。④用流式细胞仪通过细胞表面的荧(SH22containingtransformingprotein,SHC)和磷脂光强度检测EPOR的阳性率,每个样本收集10000酶C2γ(phospholipaseC2γ,PLC2γ)在信号传导中的个细胞进行分析。⑤生物素和未生物素酰基化作用。EPO对KO
5、CL233细胞EPOR表达的竞争抑制试验:先将未生物素酰基化EPO与KOCL233细胞孵材料与方法育15分钟,然后再加生物素酰基化EPO2U,其余同前。⑥结果判定:K562细胞系作为阳性对照细胞系。KOCL233细胞系分装二管,其中一管为实验材料管,另一管为不加生物素酰基化EPO作为阴性对白血病细胞系 KOCL233为日本山梨医科大照。<10%为阴性。学小儿科从婴儿急性淋巴细胞白血病建立的细胞3H2TdR掺入法 此法用来检测KOCL233细系,核型为t(11;19)。胞对EPO刺激的增殖反应。此方法为:①无菌操作主要仪器与试剂 CO2孵
6、箱,流式细胞仪,96下接种细胞系到96微孔培养板的孔中,细胞数1×微孔培养板,液体闪烁计数仪,Mini电泳装置,低510P孔。每份标本均作3个复孔,同时设对照3孔。温高速离心机,EPO(中外制药株式会社),N2hydroxysuccinimidobiotin(Sigma),PE2Avidin1山梨医科大学小儿科 日本(Biomeda),蛋白A琼脂糖珠匀浆(Pierce),增强的2000-03-30收稿;2000-10-27接受©1995-2004TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsr
7、eserved.EPO受体介导白血病细胞系KOCL233细胞增殖信号转导·111·Table1Theantibodiesusedinexperiments抗鼠或抗兔二抗孵育1小时,用增强的化学发光法显像于Hyperflim胶片上。AntibodyM.W.IsotypeofSupplier(kD)antibody免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)此方法:①-⑥步骤同Western印迹法的①-⑥,其中每Anti2EPOR55MouseIgG2aTL6支试管中的KOCL233细胞数为5×10,细胞裂解Anti2PTyr
8、MouseIgG2bkUBI液为每支试管100μl。⑦按需要分别加入抗信号Anti2SHC66P52P46RabbitIgGTL传导蛋白的抗体(按说明书稀释1∶1000-1∶Anti2PLC2γ148Mou
