大分子拥挤条件下光诱导辣根过氧化物酶还原的光谱研究.pdf

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1、第33卷第4期影像科学与光化学2015年7月ScienceandPhotochemis兰：http：／／www．yxkxyghx．org大分子拥挤条件下光诱导辣根过氧化物酶还原的光谱研究曹洪玉，王珍，唐乾，郑学仿'3(1．大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连116622；2．大连大学辽宁省生物有机化学重点实验室，辽宁大连116622；3．大连大学环境与化学工程学院，辽宁大连116622)摘要：稀溶液中光诱导辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)能够发生还原反应，但这一研究忽略了生物体细胞内因

2、存在各种分子而高度拥挤的真实环境。本文采用紫外可见、荧光、同步荧光及圆二色光谱法，研究了大分子拥挤环境中光诱导HRP的还原过程及外界环境对其光还原的影响。UV—Vis光谱和同步荧光光谱结果表明，采用403nm单色光照射时，HRP在拥挤试剂葡聚糖70(DextranT0)中还原程度较好，而HRP在聚蔗糖70(Ficoll70)拥挤环境下不发生光还原反应；采用280nm单色光照射时，在拥挤试剂DextranT0和Ficoll70中HRP光还原反应程度增加，且HRP的光还原程度在Ficoll70溶液中远高于在Dextran70

3、溶液中；光诱导HRP还原的最适温度在Dextran70和Ficoll70环境中分别为4℃和24℃；HRP在Dextran70溶液中的最佳光还原浓度是100g／L，在Ficoll70环境中HRP还原程度随着Ficoll70浓度的增加而增大；CD光谱结果表明拥挤环境中HRP被光还原后，蛋白的二级结构基本没有变化。关键词：大分子拥挤环境；辣根过氧化物酶；光照还原；光谱法doi：10．7517／j．issn．1674—0475．2015．04．321文章编号：1674—0475(2015)04—0321—09蛋白质、核酸、多糖等

4、大分子物质在细胞内的是在这种高度拥挤的环境中完成的，当蛋白存在浓度很高，使得细胞内的环境是高度拥挤的，大分于大分子拥挤环境中时，其微环境会发生改变，使子在细胞内的浓度可高达80~400g／LE，能占细得蛋白的结构及稳定性发生变化[2]，从而使得蛋胞总容积的209／6～309／6_2]，由于排斥容积效应，任白的功能表达在拥挤试剂和稀溶液中不同。何可增加可用容积的反应都能被大分子拥挤试剂生命体的重要组成部分——血红素类蛋白，刺激发生_3]。在生物体内，大多数的生化反应都在生命体中承担着极其重要的功能，例如作为生2015—04

5、—29收稿，2015—06—16录用国家自然科学基金(21271036，20871024)和辽宁省教育厅科技(L2013470，12013471)资助项目*通讯作者，Email：dlxfzheng@126．coln321322影像科学与光化学第33卷物催化剂、电子传递蛋白、氧载体和生物传感器NaHPO缓冲溶液(pH一7．4)中，配置成浓度为等_8]。由于血红素类蛋白含有原卟啉Ⅸ辅基，故其5×10mol／L的蛋白溶液，蛋白溶液冷冻避光保能够吸收特定波长的光，光照通过影响血红素功能存并尽快应用于实验。的表达而影响蛋白功能。关

6、于光照射血红素类蛋DextranT0和Ficoll70购自上海生工公司，分别白的研究已有报道，如血红蛋白、肌红蛋白、细胞色将大分子拥挤试剂DextranT0和Ficoll70溶解到pH素P450、细胞色素C、细胞色素C氧化酶和辣根过7．4的PB缓冲溶液中，使其终浓度达到50g／L、100氧化物酶等l9。，但是这些研究是在稀溶液中进行g／L、200g／L和400g／I，实验用水为去离子水。的，忽略了生物体细胞内的拥挤环境。目前关于血实验仪器主要有UV—Vis分光光度计(V_红素类蛋白在高度拥挤环境下光照的研究还很少。560

7、，日本Jasco公司)，荧光光谱仪(FP一6500，日本辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，Jasco公司)和圆二色光谱仪(J一810，日本Jasco公HRP)是以铁卟啉为辅基的血红蛋白，辣根过氧化司)，制冷和加热循环器(F—l2，德国Julabo公司)，物酶能利用过氧化氢氧化一些有机和无机化合实验室pH计(PHSJ一4A，上海雷磁分析仪器厂)，物，它与植物的呼吸作用、光合作用及生长素的氧实验所用光源为荧光光谱仪的氙灯。化等都紧密相关，而且对氧自由基具有消除作用，1．2实验过程减少过氧化物对植物体

8、的毒害作用。辣根过氧化1．2．1样品处理物酶在生物传感器[1、环境监测、工业应用等取2OL浓度为5×10mol／L的HRP蛋白方面也发挥了很大的作用，广泛地运用于基因学、分别加入到1．98mIPB缓冲液和已配好的生理学及病理学研究中E17,18]。DextranT0、Ficoll70溶液中，得到浓度为5×10我们最近