三种农田土壤中氨氧化细菌amoa基因多样性比较分析

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1、万方数据第49卷第2期2012年3月土壤学报ACTAPEDOLOGICASINICAV01．49。No．2Mar．，2012三种农田土壤中氨氧化细菌amoA基因多样性比较分析木汪峰1’2’3，4曲浩丽1丁玉芳1孙波3崔中利1曹慧H(1南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室，南京210095)(2南京农业大学资源与环境科学学院，南京210095)(3中国科学院南京土壤研究所，南京210008)(4中国科学院研究生院，北京100049)摘要比较分析中国东部不同季风气候区中海伦黑土(HL)、封丘潮土(FQ)和鹰潭红壤(YT)3种土壤氨氧化细菌amoA基因

2、多样性。采用非培养方法直接从土壤中提取微生物总DNA，用氨氧化细菌amoA基因特异引物扩增总DNA，构建了3种土壤amoA基因文库，并对文库进行限制性长度多态性(RFLP)分析。HL、rQ和YT的amoA基因文库克隆数量分别为49、50和48个，相应的RFLP类型数为10、10和14个OTUs，其中有4个OTUs为三种土壤共有；YT中氨氧化细菌amoA基因多样性指数最高，rQ最低；HL和FQ群落的相似为70％，HL与YT的相似度为50％，而FQ和YT之间仅为42％，说明氨氧化细菌具有地理分布的规律：17个amoA基因序列可以被聚成6个cluster，分属Nit

3、rosospira和Nitrosomonas两个属。三种农田土壤中均存在丰富的氨氧化细菌，表明氨氧化细菌在农田土壤氮素循环中具有重要作用。关键词氨氧化细菌；amoA基因；RFLP分析；农田土壤；微生物多样性中图分类号Q938文献标识码A氨氧化细菌(Ammonia—oxidizingbacteria，AOB)是一类重要的功能微生物，它通过氨单加氧酶(Am—moniamonooxygenase，AMO)的催化作用将氨氧化成羟胺，是硝化作用过程的起始和限速步骤⋯。氨单加氧酶是一种膜结合蛋白，由多种亚基组成，相应的编码基因位于amoCAB操纵元上旧⋯，其中含有Ot亚基

4、(amoA)基因是良好的分子标记，广泛用于环境中AOB多样性研究H1。土壤中化能自养型AOB绝大部分属于B．变形杆菌(p-Proteobacteria)，包括亚硝化单孢菌(Nitrosomonas)和亚硝化螺菌(Nitrosospira)两个属’51。由于AOB生长慢、数量少、代时长，对营养条件的要求专一性很强，这些因素使得人们用传统的培养方法分离与纯化AOB有很大的困难‘60。近年来，通过构建16SrRNA和amoA基因文库等方法，对水体、河湖沉积物以及土壤等环境中的AOB群落结构进行了大量研究，已经揭示出这些环境中存在着大量的AOB类群与数量H⋯。土壤与微

5、生物的作用是相互的，土壤的理化性质等差异对AOB的多样性造成影响，而AOB群落组成和数量的变化，将会影响到土壤的硝化作用，以及土壤氨态氮的氧化，改变土壤中NH：和N03的相对库容，从而影响土壤中氮素的淋失和土壤的酸化。我国的农田土壤广泛分布在东部季风区，南北纬度跨度较大，水热条件以及土壤理化性质在着差异。开展不同气候带土壤AOB的比较研究，有助于了解AOB群落组成特征，揭示不同气候下农田土壤与AOB多样性之间的关系，为采用微生物调控措施提高农田氮素利用效率、保护农田生态环境提供科学依据。1材料与方法1．1样品采集地状况及样品采集利用中国科学院生态系统研究网络(

6、CERN)，沿中国东部南北热量梯度带上选择3个农田生态系统国家野外科学观测研究站，即海伦、封丘、鹰潭试验站。3个站点分布有中国典型的农田土壤，东北松嫩平原的海伦为黑土、黄淮海平原的封丘为潮土、南方丘陵区的鹰潭为红壤，上述3种土壤分别记为HL、{国家自然科学基金项目(40871125，40871123)资助十通信作者，Tel／Fax：+86—25—84396753；E—mail：hcao@njau．edu．cn作者简介：汪峰(1982一)，男，安徽潜山人，硕士研究生，研究方向为土壤微生物分子生态学。E-mail：2007103022@njau．edu．ell收稿

7、日期：2011—04—13；收到修改稿日期：2011—08—03万方数据348土壤学报49卷FQ、YT。采集试验小区每年种植一季玉米，采集时间为玉米生长旺盛期，其中海伦黑土采集时间为2008年7月28El、封丘潮土为2008年7月30日，鹰潭红壤为2008年6月4日。各试验小区施肥量为N150kghm～、P20575kghm～、K2060kghm～，NPK肥料分别为尿素、(NH。)：HPO。和KCl。每小区采集10点混合土样，用不锈钢土钻(直径2cm)钻取0～20cm耕层土壤，用四分法留取土样，用保鲜箱低温冷藏带回实验室。去除石块和植物根系后，一部分土样风干磨

8、碎进行理化性状的测定，一部分放在一20