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1、主鱼生丝鱼鱼堂奎宣丝丝全笙旦兰签全鱼匕重组技术在实验动物科学中的应用魏汛第三军医大学实验动物学教研室,重庆,,“重组技术是基因工程的核心指在体外条件下将不同生物的基因进行人工剪”“”“”,,、切组合和拼接使遗传物质重新构建然后通过载体如细菌质粒噬菌体和病毒,,产生等转入受体细胞内进行无性繁殖并使所需要的基因在受体细胞内表达人类所需要的,。、、基因或产物或创建新的生物类型重组技术涉及核酸分子杂交技术反应限制性核酸内切酶等工具酶的应用、基因转移等多项技术方法,本文就它们在实验动物科学中的应用作一综述。核曦分子杂交技术两条互补单链复性变为双链的现
2、象称为核酸分子杂交。核酸分子杂交不仅可以在两条互补链之间进行,也可在互补和链之间进行。如果把单链或用合适的标记物如放射性同位素,生物素、地高辛予以标记,当作探针,进行杂交,、,反应并用合适的方法如自显影术显示反应把标记物检测出来也就把发王分子杂交这一事实给予了肯定。伺时由于标记探针是预先知道的基因片段或特定序列,就可推定与之‘。,,此杂交的核酸链是与探针为同源片段或序列即为核酸分子杂交技术根据杂交反应环境核,酸分子杂交可分固相杂交和液相杂交固相杂交是将先固定在膜上硝酸纤维素膜或尼龙膜,,漂洗除去未杂交,然后加入标记探针在溶液中进行杂交的探针
3、再进行检测。液相杂交是标本中的与探针在溶液中进行杂交。常用的固相杂交方法及其特点见附表。附裹核酸分子杂交方法杂交类型特点说明几印迹杂交酶切后转移到膜上酶切图谱特定序列分析五几印迹杂交转移到膜上特定序列分析斑点杂交或标木点在或抽滤在膜上疾病诊断菌落杂交菌落或菌苔点种在膜上疾病诊断、病原菌鉴定,菌落原位杂交和噬菌斑原位杂交用于克隆株的筛选夹心杂交未标记探针先吸附于膜上,用于污染标本疾病诊断与标本杂交后,再加标记探针特异性更强与标本杂交原位杂交细胞和组织病理切片主要对病毒病诊断、细胞内病毒定位©1994-2010ChinaAcademicJour
4、nalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net反应聚合酶链反应,,又称无细胞克隆技术,是一种对特定的片断在体外进行快速扩增的方法,在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至,。一个分“子扩增倍大大地提高了的得率反应体系只需要一个检测的靶作为复制模板,一对与靶两端互补结合的寡核昔酸作为引物,一种聚合酶及其所需的底物即四种脱氧单核昔酸以及最适反应条件等。所采用的样品很广泛,用量甚少而且无苛求,只要含微量靶的体液、组织细胞、分泌排泄物、石蜡切片等均可作为检测对象。引物
5、需按靶两端已知序列,预先设计合成,一般长度为、个硷基,其中十含量占肠左右为宜,引物内部或一对引物之间应无互补序列,并尽力避免引物与非靶序列之间有同源性。的三个基本步骤高温℃使靶变性成单链模板低温一般为℃退火,让引物与模板特异结合在适温一般为℃下,‘一‘,、,聚合酶随引物方向延伸新链经反复上述变性退火和延伸等循环、次可使靶扩增“、。倍,经电泳和嗅化乙锭染色,肉眼即可判断结果。核酸分子杂交技术及反应在实验动物科学中的应用实验动物微生物学检测传统的方法多是以免疫学方法检测病原体抗原及其在动物体内产生的抗体,或者使用不同的方法分离培养微生物,它们有
6、时存在灵敏度特异性低及速度慢等问题,有的病原体侵入机体后需潜伏一定时间后才出现抗体,用免疫学方法很难及时检测出来,一些持续感染却不能积极产生病毒颗粒的病毒,通过检测抗原的方法,难以检测到病毒,有的病毒的血清学检测只能确定是否接触过这种病毒,但不能肯定是否存在现行感染。核酸分子杂交技术可克服以上不足,并可用于动物群体的大量检测工作,其灵敏度很高,尤其是反应,有时甚至存在一个病原体即可检出,其取材范围广,可从动物的血、尿、粪便、分泌物、体液、涂片、,、。,活检或尸解标本中直接检测也可应用组织培养或细菌培养标本组织切片检测同时目前已有大量的基因探
7、针、寡核昔酸引物可供检测使用,运用这些探针、引物进行核酸分子杂交、反应,可以对大量的病原体病毒、细菌、寄生虫进行检测。据不完全统计,在实验动物有关病原体方面,已进行了病毒、狂犬病毒、流行性出血热病毒、巨细胞病毒、轮状病毒、细小病毒、腺病毒、慢病毒、鼠沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、绿、、‘。脓杆菌肺炎支原体弓形体等的应用研究〔’“〕。等对人工感染鼠肝炎病毒一小鼠的组织进行了检测,小鼠腹腔接种病毒后仅,即可从感染鼠的肝及脑组织中扩增出其病毒核酸,而以巧法进行抗体的检测,在接种后仍呈阴性,表明是实验动物鼠肝炎病毒检测的敏感方法〔“〕。实验动物遗传
8、学检测在生物进化过程中,由于各种原因引起内核昔酸排列顺序改变,当这种改变涉及到限制性内切酶识别位点时,利用限制性内切酶可将切割成不同长度的限制性片段。这些具有不同长度的限制性片段
