marc-145细胞无血清培养驯化、代谢分析及prrsv增殖能力比较

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1、DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2012.07.003—182—江苏农业科学2012年第40卷第7期冯磊，吴培培，褚轩，等．Marc－145细胞无血清培养驯化、代谢分析及PRRSV增殖能力比较［J］．江苏农业科学，2012，40(7):182－185．Marc－145细胞无血清培养驯化、代谢分析及PRRSV增殖能力比较冯磊，吴培培，褚轩，王伟峰，侯继波(江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014)摘要:采用逐步降低培养液中血清用量的方法对Marc－145细胞进行无血清培养驯化并考察其生长代谢、

2、增殖PRRSV(猪繁殖及呼吸综合征病毒)的能力。结果表明，通过在细胞对数生长期更换低浓度血清的培养液或传代操作，Marc－145细胞可完全适应含5%新生牛血清的营养条件，经3次传代后，Marc－145细胞可营正常贴壁生长。然而在1%新生牛血清的营养条件下，初次培养于该条件的Marc－145细胞伪足不伸展，贴壁时间明显延长。经过在该1%血清浓度下10次传代后，Marc－145细胞可贴壁生长，维持较高的存活率，但贴壁较松。由此Marc－145细胞进一步驯化适应无血清悬浮培养条件，筛选获得能够在无血清条件下悬浮生长的Marc－145细胞，且生长状态良好。

3、比较在不同血清浓度及不同培养方式下生长的Marc－145细胞增殖PRRSV的能力，无血清条件下悬浮生长的Marc－145细胞对PRRSV的增殖性能没有改变。关键词:Marc－145细胞;驯化培养;无血清培养;PRRSV中图分类号:Q813．1文献标志码:A文章编号:1002－1302(2012)07－0182－04Marc－145细胞源于恒河猴肾母细胞MA－104，是目前1材料与方法猪蓝耳病病毒即猪繁殖及呼吸综合征病毒(porcinereproduc-tiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)体外增殖的宿主细1．1

4、材料［1］胞，用于生产猪蓝耳病疫苗。Marc－145细胞通常在含有Marc－145细胞为国家兽用生物制品工程技术研究中心10%血清的培养基中培养，添加高浓度血清存在诸多问题:血(以下简称中心)保存细胞株。PRRSV毒株为中心保存毒株。清成本占培养液总成本的50%～80%，生产成本大幅提高;低血清培养液:DMEM固体培养基购自北京清大天一科技有限不同批次的血清存在质量差异，导致疫苗产品质量不稳定;疫公司，新生牛血清(newbornbovineserum，NBS)购自Gibco公苗产品的下游分离纯化及制剂工艺要求高，血清的存在不仅司。按操作说明配制，其

5、中加入2．0g/LNaHCO3，100IU/mL增加分离纯化难度，同时也影响疫苗产品的浓缩及剂型选择青霉素，100μg/mL链霉素。根据试验需要，加入一定量的血［2］等。无血清培养动物细胞进行重组蛋白、单抗、疫苗生产清，分别配制成含有10%、5%、1%(V/V)血清的DMEM培养是目前生物医药产业新技术的发展方向，但具体到某一种生液，0．22μm无菌膜过滤，置于4℃冰箱冷藏避光备用。无血产用细胞，其对无血清培养条件的适应需要一定的驯化过清培养液:以DMEM/F12(1∶1)培养基(购自Gibco公司)为［3－4］程。通常驯化过程会采用逐步降低血清用

6、量的方法，动基础培养基，添加大豆蛋白水解物、酵母提取物、转铁蛋白、激物细胞在经历一段低血清培养驯化后最终实现无血清培养。素、F－68等成分(均购自Sigma公司)配制而成，经0．22μm在整个适应驯化过程中，动物细胞的生长速率、生理代谢及其无菌膜过滤，置于4℃冰箱冷藏避光备用。特定生产能力(如目的蛋白的表达效率、对病毒的敏感性)都2．2细胞驯化培养方法可能发生改变，及时分析比较驯化前后细胞之间的差异，有助低血清逐步适应方法:正常贴壁培养的Marc－145细胞于筛选出生长旺盛、代谢正常并且保持较高生产能力的细胞在对数生长期将含有10%血清的培养液更换

7、为含有5%血清［5－6］克隆株。的培养液，促使细胞提前适应低浓度血清的营养条件。待细本研究以Marc－145细胞为对象进行低血清逐步驯化培胞逐步长满生长皿表面，正常消化传代至含有5%血清的培养，在驯化过程中分析比较Marc－145细胞的生长、代谢及对养液中生长，3次传代后，Marc－145细胞基本适应了含有PRRSV的增殖能力，筛选出稳定高效的Marc－145细胞株，5%血清的营养条件。从含5%血清的培养条件驯化至含1%进而获得能够适应无血清培养条件的Marc－145细胞株，旨血清的培养方法基本同上，但驯化传代次数稍多。在为大规模无血清工业制备猪蓝

8、耳病疫苗奠定基础。无血清驯化适应方法:以适应了1%血清培养条件的Marc－145细胞为出发细胞，在经过硅化处理的spinn