safracinb的菌种选育及发酵工艺_王向阳

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1、中国医药工业杂志微生物药物与生物技术的菌种选育及发酵工艺王向阳，陈少欣中国医药工业研究总院上海医药工业研究院，，创新药物与制药工艺国家重点实验室上海摘要一株高产突变：以产生菌荧光假单胞菌为出发菌株，经紫外和亚硝基胍诱变和筛选，得到株其的产量为通过优化发酵培养基，得到最适培养基配方（甘露醇甘油，。黄豆饼粉，玉米浆干粉氣化铵在上述条件下一。的摇瓶产量为。进步在发酵罐进行培养，的产量达到：荧光假单胞菌关键词；菌种选育：发酵中图分类号：文献标志码：文章编号：，，；是加勒比海鞘本，科学家开发出从半合成口一种四氢异喹啉的生

2、产工艺提取物中的。是从焚光假单胞菌而生物碱，年由西班牙的发酵液中分离到的生物碱类抗生’公司开发为治疗软组织肉瘤和卵巢癌的素，和的结构见图。目前的发酵⑴，药物。抗肿瘤活性研究表明其活性比临床单位较低本研究旨在通过菌种选育和优化发酵培，广泛使用的喜树碱，，为合成提供关键前体、多柔比星、博来霉素等高适养基组成提高其产量用于蒽环类药物和异环磷酰胺治疗失败°的晚期组织°、肉瘤患者，直接提取。由于海鞘中含量低。生产成本过高’不适合产业化生产为降低生产成收稿日期：“”基金项目：国家重大新药创制科技重大专项作者简介，从事生物药

3、物研究。：王向阳（丨，助理研究员丨通信联系人：陈少欣研究员，从事生物药物研究。图和的化子！口构：..114中国医药工业杂志，，仪器与试药结果显示，照射荧光假单胞菌的致死型高效液相色谱仪（美国公司）：率为将诱变后的菌悬液稀释涂布于。型玻璃发酵罐（上海保兴生物设备工程有平板，培养挑取单菌落到涂有大肠杆菌限公司）。的平板上，继续培养挑取抑菌圈较“”对照品（本室制备，纯度亚硝基胍大的单菌落，按项下方法进行摇瓶发酵培曰本东京化成工业株式会社；乙腈和甲醇为色谱纯，养，从中挑选发酵单位提高的突变株，经过连续几其他试剂均为分析

4、纯。轮诱变后，得到高产菌株产量为荧光假单胞菌本室保藏）。比出发菌株提高了倍。固体培养基蛋白胨酵母提诱变：精密称取加入适量取物，琼脂。丙酮溶解，然后加入磷酸盐缓冲液（，种子培养基葡萄糖丨，蛋白胨配制成的母液。以丨，为出发菌株进行诱变，将培养好的斜面用发酵培养基‘：甘露醇葡萄糖黄豆饼制成菌悬液，取出置灭菌的三角粉’，；瓶中，加入适量母液，使终浓度分别为°。、、、和振荡（方法与结果培养，考察的最适浓度；并以最适浓培养条件度分别处理、、、、和以确定斜面培养：将保存的菌种转接到斜面培养作用时间。结果显示，终浓度作用基上°

5、，培养荧光假单胞菌的致死率为。同上操种子液体培养：将斜面菌种接种到装量为作进行筛选，经过连续几轮诱变后，得到高的种子摇瓶中。，振荡产菌株产量为比出发菌株培养。提高了倍。发酵液体培养：将种子液按接种量转接到将突变株接种到斜面培养基上连续。装量为的发酵摇瓶中”，于振荡传代次，分别按项下方法进行发酵培养，培养。结果产量均大于表明该突变株遗传稳的含量测定定性良好。取发酵培养液离心（取发酵培养基优化上清液经滤膜过滤后采用法测定。碳源优化”色谱条件：色谱柱柱（以项下的发酵培养基为基础培养基，将流动相乙腈：乙酸铵溶其中的葡萄

6、糖分；别替换为浓度为和的麦。“”：流速温液（；柱检测波芽糖、、、半乳糖乳糖蔗糖、甘油和豆油，按长进样量口。根据对照品浓度计算发项下方法发酵培养后测定。结果见表。酵液中的含量。由结果可知，该菌株能利用多种碳源进行生长，菌种诱变与筛选当以的甘油为碳源时，相对产量较高。可能紫外（诱变：将培养好的斜面菌种用无菌以甘油作为碳源可以减少葡萄糖效应，从而有助于水制成菌悬液，取出置灭菌的培养皿中，次级代谢产物的合成。紫外灯下边搅拌边照射一（功率照射距离进步调整培养基中甘露醇（分别照射、、、、和。和甘油（的比例，两者总量为中国医

7、药工业杂志，表不同碳源对产量的影响碳源葡萄糖麦芽糖半乳糖乳糖蔗糖甘油豆油“相对产量注：括号内外分别是和浓度相应结果；葡萄糖参照浓度为，结果显示，加入适量甘油有助于提高产量但其搅拌溶氧（自控在以上（与产量随甘油浓度的升高而下降，。当甘露醇为转速关联）通气量罐压用，相对产量较高甘油为时。氢氧化钠溶液维持值约。从发酵过，每隔定时取样，结果见图氮源优化程的第开始。，以碳源优化后的培养基为基础培养基，将可见，在发酵过程的第，菌体开始迅速生长的黄豆饼粉，值和溶氧快速下降，（对照）分别替换为不同浓度（％此时菌体浓度和转速升高

8、的黄豆饼粉、氯化为了维持足够的溶氧，转速由增加到（、和玉米浆干粉，按和硫酸铵、、和小麦蛋白粉、。在发酵过程的第开始合成比菌（均为一，酵母粉和酵母提取物。体生长推迟段时间。随着发酵时间的增加产（均为、和三水平）“”％量逐渐提高项下方法发酵培养测得相对产量，在时产量达到最高为按（，、、分别为、、黄豆饼粉）、但发酵后期由于甘露醇浓度的快速降低导致菌体的，玉米浆干粉，、、、氯；衰退产量也随之降