电镜原位分子杂交技术及其应用

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1、!"卷#期生物工程学报&’()!"*’)##$$#年%月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12+,-./#$$#!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!电镜原位分子杂交技术及其应用谢潮添"杨盛昌缪颖陈德海张平（厦门大学生命科学院植物基因与基因技术研究所，厦门%4!$$7）摘要将原位分子杂交技术应用于电镜水平，观察标记的特定?*@、9A*@和AB@在细胞和C或组织内的超微结构定位的方法，称为电镜原位分子杂交技术。本文综述了电镜原位分子杂交技术的建

2、立及其分类，并详细介绍了非放射性电镜原位分子杂交技术的基本操作程序及注意事项，最后对电镜原位分子杂交技术的应用做了简要介绍。关键词电镜，原位分子杂交技术，操作程序中图分类号D0%%4文献标识码E文章编号!$$$0%$4（!#$$#）$#0$#210$2电镜放射性原位杂交技术应用放射性同位素作为标记，!概述具有敏感性高，标记物不会干扰杂交反应，并且结果适合于进行定量分析等特点。常用的几种放射性同位素：%%7!"!电镜原位分子杂交技术的建立B，W，!#7%#F,((F和G,-HI6+（!141）［!］创立原位杂交（3$&#/)/JK-:H0R和G都已经

3、被用于电镜原位杂交，但各有优缺点，目前应用最广泛的放射性标记物是%7:L,;:’>）技术以来的%$年内，该技术在各个领域得到了广泛W。应用。但在大部分的研究工作中，杂交信号都是用光学显微电镜非放射性原位杂交技术由于无放射性污染，不需耗镜进行观察并记录的，这样在分辨率上就存在很大的限制，时较长的放射自显影过程，其杂交信号的亚细胞定位甚至比为了对检测的特异核酸进行更精确的亚细胞定位，以便将组同位素探针好，因此目前已有取代放射性原位杂交技术的趋织、细胞和染色体等水平上?*@或A*@定位与超微结构相势。其中地高辛标记的探针具有操作简便、灵敏度高、背景［"］

4、互联系起来，许多学者就试图将其与电镜组织化学技术相结低等特点，已成为目前应用最广泛的标记物。合，并由此建立了电镜原位分子杂交技术（8(6.;-’>9:.-’M.’0!"#"#按操作程序的不同分类：依电镜原位杂交技术的操N:.#$&#/)/JK-:H:L,;:’>）。作程序，它可分为包埋前电镜原位杂交，包埋后电镜原位杂［1］!13!年O,.’KO等首先进行电镜水平的原位杂交获得成交和不包埋电镜原位杂交%种。它们也各有优缺点：［#］不包埋电镜原位杂交技术能最大程度地保存细胞和细功，但是超微结构的保存极不理想。随后很多学者对这一技术进行了改进，P:>H6

5、-+等（!1"4）用生物素标记的-?*@胞中的核酸含量，杂交信号也比较强，但冷冻过程会在一定探针及QR探针在用S’T:.-J(U2+低温包埋的切片上进行杂程度上损害细胞的超微结构；包埋前电镜原位杂交技术操作交，以蛋白@和胶体金复合体作为显示系统，超微结构的保比较容易掌握，杂交反应不受电镜包埋过程的影响，细胞的存及杂交效率有了明显的改善，并获得了较高的信噪比［%］。超微结构也比较清晰。缺点是反应产物大小难以控制，大量V:M./6-?等（!11#）率先采用地高辛作为标记，金标抗地高辛反应产物有时会掩盖准确的超微结构定位；包埋后原位杂交抗体做显示剂进行原

6、位杂交，并用银显示法加强，获得了极技术在原位杂交前的电镜生物样品处理过程中，核酸降解量［2］较多，因此只适合于核酸含量较多的细胞和组织。为满意的定位。目前电镜原位分子杂交技术在国外还处在不断提高和#电镜原位分子杂交技术的基本操作程序［7］［4］完善的阶段，而在国内则刚刚起步，焦仁杰，梁凤霞，杨［3］本文只以非放射性原位杂交技术为例介绍电镜原位杂木兰等都对这一技术进行了一定程度的探讨。!"#电镜原位分子杂交技术的分类交技术的基本操作程序。!"#"!依标记物的不同分类：电镜原位杂交技术依据其标#"!材料的固定记物的不同可分为电镜放射性原位杂交技术和电镜

7、非放射在电镜原位杂交中，要获得清晰完整的超微结构图像，性原位杂交技术。最大限度地保持细胞内的?*@或A*@分子的完整性，使探收稿日期：#$$!0$10!"，修回日期：#$$#0$!0$2。基金项目：国家自然科学基金资助（*’)%1"3$24!）。"通讯作者。56(："4071#0#!"2$4#；809,:(：.;<:6=!4%)>6;&%#生物工程学报.D卷针容易进入细胞或组织，选择合适的固定剂及固定时间对新的探针杂交更弱的信号，其可能原因是虽然长的探针穿透能鲜的组织迅速固定是至关重要的。力差，却有更多的机会与目标核酸杂交，并获得稳定的杂交［.&］

8、常用的固定剂如戊二醛，甲醛等交联性固定剂能较好地体。保持细胞和组织的超微结构，也能有效地保存组织细胞中的至于探针的浓度一般