KRAS基因突变直接测序检测方法的建立-论文.pdf

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1、国际医药卫生导报2014年第2O卷第2期IMHGN，January2014，Vo1．20No．2·论著·KRAS基因突变直接测序检测方法的建立容毓罗凯贺智敏【摘要】目的建立一种适用于临床的KRAS基因直接测序突变检测方法。方法以KRAS基因l2、13密码子为突变检测靶位点设计特异性扩增、测序引物，以已知12、13密码子野生型、突变型样品分别做为阴、阳性对照品，建立KRAS基因突变直接测序检测方法，并行方法学评估。结果成功建立了KRAS基因突变直接测序检测方法，该方法检测灵敏度达3．9ng／l，重复性良好。检测17例结直肠癌样品，突变率为23．5

2、％。结论本研究成功建立了可用于临床样品检测的KRAS基因突变直接测序检测方法。【关键词】KRAS；突变；基因测序；结直肠癌EstablishmentofasequencingmethodfordetectingKRASgenemutationsRongYu．LuoKaLHeZhimin．TheAffiliatedTumorHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510095,China【Abstract】ObjectiveToestablishasequencingmethodfordetec

3、tingKRASgenemutations．MethodsAsequencingmethodforKRASgenemutationsdetectionwasestablishedwithspecificprimersthattargetedhotspotmutationregion(codonl2andcodonl3)，andwild-typeandmutationsampleswereselectedasnegativesampleandpositivesamplerespectively．Thentheperformanceofthemet

4、hodwasassessed．ResultsAsequencingmethodforKRASgenemutationsdetectionwasestablishedsuccessfullywhichownedhighsensitivity(3．9ng／1)andgoodrepeatability．Themutationratewas23．5％in17colorectalcancersamples．ConclusionThesequencingmethodcanbeusedinclinicalsamplestodetectKRASgefiemut

5、ations．【Keywords】KRAS；Mutation；Genesequencing；ColorectalcancerKRAS基因是RAS癌基因家族中的一员，分GTP的亲和力发生改变或失去内在的GTP酶活离自人肺部细胞，与Kirsten大鼠肉瘤病毒基因为性，从而导致RAS蛋白持续处于活化状态，不断同系物，故称为KRAS。其定位于12号染色体，激活靶分子，引起信号传导的持续效应，刺激细基因全长38167bp，mRNA全长2707nt，含4个胞持续生长或分化，使细胞具有恶性潜能最终导外显子和1个5’端非编码外显子，外显子编码致细胞的恶性转化Ⅲ

6、。在欧美的结直肠癌患者中，一个189个氨基酸的蛋白，分子量21kDa，称为KRAS基因的突变率可达30％～68％’。Rasp53蛋白。RAS蛋白属于G蛋白家族中的一种目前，表皮生长因子受体单抗已经应用于小G蛋白，为一种膜结合型的GTP／GDP结合蛋白，转移性结直肠癌的分子靶向治疗。以2号外显子主要参与细胞的增殖和信号传导过程。当KRAS12、13密码子突变为主的KRAS基因突变的结直基因发生突变激活时，可使RAS蛋白对GDP和肠癌患者对表皮生长因子受体单抗靶向治疗具有抗性l4'。因此检测KRAS基因12、l3密码子突变对于指导结直肠癌患者的靶向

7、治疗具有重要意义。DOI：10．3760／cma．j．issn．1007-1245．2014．02．008直接测序法目前仍是基因突变检测的“金标作者单位：510095广州医科大学附属肿瘤医院广州医科大准”方法，具有结果准确、重复性好、可检测已学肿瘤研究所知与未知突变等优点【6]。但不同的扩增片段选择，通信作者：贺智敏，E—mail：hezhimin2001@yahoo．con．cn172国际医药卫生导报2014年第20卷第2期IMHGN，January2014，Vo1．20No．2PCR扩增引物、测序引物的设计会严重影响直接1．4实验条件经系列

8、预实验获得优化实验条件测序法检测突变的效率和特异性，因此选择合适如下。的扩增片段、设计和筛选理想的PCR扩增引物和1．4．1样品前处理与DNA提取新鲜