细胞转染技术.doc

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1、细胞转染技术常规转染技术口J分为两大类，-•类是瞬时转染，一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此-•个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产工高水平的衣达，但通常只持续几天，多用于启动子和英它调控元件的分析。-般來说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果，常常用到-些报告系统如荧光蛋门，(3半乳糖井酶等來帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为-种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入杲低但藥合率高

2、。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过-•些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH；新霉素抗性基因)，潮霧素B磷酸转移酶(HPH),胸廿激酚(TK)等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。转染技术的选择対转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数帚，培养及检测时间等。•吐传统的转染技术，如DEAE右旋糖苛法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊近年来国你丄推出了…些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范闹广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝

3、状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进-•步改性，口:其合成匸艺复杂。聚乙烯亚胺是-•种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔一一个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(protonsponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进•步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，ifuJ1它的细胞毒性低。人呆实验证明，PEI是非常有希望

4、的基因治疗载体。目询在设计更复杂的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。线羽PS(LinePEI丄PEI)与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI(BranchedPEI,BPEI)要早•些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞迫位，因此与BPEI相比应该转染效率高-吐。但垠近研究农明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同吋细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验屮发现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。G

5、enEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件卜对降解键的交联剂交联，合成出的…系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的止电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从

6、何提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，英中所含的心理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI,这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对•体内应用也具有重要的意义。麒方法解翻DNA豁姗般勰鶴射§毗捲隸不适肝獻狐

7、砒便血瞇电羽电不傘DEAE-$Wf寿三电的DEAEm逋諾愿#电術锻髒肛干磁合物劇相对筲邑隸可藪*三强-定潴副f網射吞齐二亏二三电苗左聶神电压麟纏瀬巴DNAfiit壯场成的小孔导入稳定隸彌旺戲1級孵乐DNA純躺I*.疏揭不卿献就化电纭血汩註细财外源範始殲触中可野轶渠的継、獻灘.紐细觥宿主灘□謎因不能太大灘需处分裂期士祐E三至汀•左空三•游可用于糕躺细11色体中赭額鈕素阳曲酬法二応适能二除麟总裁幽,砂染踹險血汛馭獗随灘类型变化大Biolistic題紇号机na載袒釧琳丸m枝好的灘用池訝貓M赢DNA在担板猝放，哥达可用,人触諭亂細倉1巴细邸

8、以及！TW養朝絲鹽DNA薛注入删鮒隐定翳隸継如/纵贏略咖曲臨］口曲影响转染实验的因素转染技术是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术。随着分子4物学和细胞山物学研究的不断发展，转染己经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因农达、突变分析和蛋门质生产等生物学试验屮，其应用越來越广泛。影响转染效率的因索有很多，细胞株木身的特性和活性，细胞培养条件，转染的DNA或RNA的质量，转染方法，转染试剂的选择等。常规转染技术口J分为两大类，-•类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不

9、整合到宿主染色体中，因此-•个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产工高水平的衣达，但通常只持续几天，多用于启动子和英它调控元件的分析。-般來说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到-