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1、ISSN100727626中国生物化学与分子生物学报2005年2月CN1123870PQChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology21(1):35～38利用Red重组系统对大肠杆菌ClpP基因的敲除3白光兴, 孙志伟, 黄 莺, 俞炜源(军事医学科学院生物工程研究所,北京 100071)摘要 利用含有质粒pKD46的菌株BW25113,在阿拉伯糖诱导后,表达λ噬菌体的3个重组蛋白,宿主菌就具有了同源重组的能力.设计的引物5′端有50bp的拟敲除基因的同源臂,3′端为扩增引物,
2、以pKD3为模板,扩增两侧含FRT位点的氯霉素抗性基因,将此线性片段电转入具重组功能的感受态细胞,利用氯霉素平板就可以筛选到阳性转化体.再利用表达Flp重组酶的质粒pCP20,可将FRT位点之间的氯霉素抗性基因删除.利用该重组系统,构建了ClpP蛋白酶缺失的大肠杆菌工程菌株,可望在减少外源蛋白的降解方面发挥一定的作用.关键词 ClpP,FLP重组酶,FRT位点,Red重组酶中图分类号 Q789DeletionofclpPinChromosomeofE.colibyRedRecombination3BAIGuang2Xing,S
3、UNZhi2Wei,HUANGYing,YUWei2Yuan(InstituteofBiotechnology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China)AbstractPlasmidpKD46canexpressthreeproteins:Gam,BetandExo.GaminhibitsthehostRecBCDexonucleaseV,sothatBetandExocangainaccesstoDNAendstopromoterecombination.BW
4、25113withpKD46hasthefunctionofrecombinationwheninducedbyL2arabinose.PCRproductswereobtainedbyusingprimerswith502bpextensionwhichwerehomologoustoclpPandbyusingtemplateplasmidnamedpKD3carryingchloramphenicolresistancegeneflankedbyFRTsites.ThePCRproductswereintroducedi
5、ntoBW25113byelectroporation.Thestrainsexpressingchloramphenicolresistancegenewereselectedbychloramphenicolagar.Thechloramphenicolresistancegenewastheneliminatedbyusingahelperplasmid,pCP20,encodingtheFlprecombinase.Usingthissystem,ClpPgeneinchromosomeofEscherichiacol
6、iwasdeleted.KeywordsClpP,FLPrecombinase,FRTsites,Redrecombinase[2] 在基因工程的研究工作中,外源蛋白在大肠杆白.其机制是识别蛋白质C端的多肽序列菌中降解是一个经常遇到的问题,主要原因是大肠ANDENYALAA,在ClpA或ClpX的协助下,将含有此杆菌的蛋白水解酶识别并切割了外源蛋白的特异性序列的肽链降解.本研究拟在现有的工程菌株中通氨基酸序列.目前所用的大肠杆菌工程菌株中,已有过敲除ClpP基因,构建一个蛋白酶缺失的新菌株.Lon蛋白酶缺失的菌株,如BL21
7、(DE3)等.但是,不传统的基因敲除需要利用RecA蛋白的同源重同蛋白酶识别和切割的序列是不一样的.显然,一种组功能,构建环状的打靶载体.这种载体有3个重要蛋白酶的缺失不能减少如此众多的外源蛋白的降解,建立新的蛋白酶缺失菌株是非常必要的.收稿日期:2004202225,接受日期:2004204229ClpP属于Clp分子伴侣家族,与ClpA、ClpB和国家高技术研究发展计划(863计划)十五课题(No.2001AA215351)ClpX相结合,能降解大肠杆菌内的一部分蛋白3联系人 Tel:(010)66948828,E2mai
8、l:Yuwy@nic.bmi.ac.cn[1]质.ClpP属丝氨酸型蛋白酶,由2个七聚体形成的Received:February25,2004;Accepted:April29,2004环状结构叠加而成.ClpP可直接降解短肽片段(少SupportedbyNationalHi
