NDV抗血清制备及抗体效价测定.pdf

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1、NDV抗血清制备及抗体效价测定【实验目的】1.学习抗血清制备的基本原理，掌握兔和小鼠免疫注射方法、兔颈动脉放血、小鼠眼球采血技术。2.学习双向琼脂扩散实验的基本原理，掌握的基本程序和结果判读方法。3.学习酶联免疫吸附实验（ELISA）的基本原理，掌握间接ELISA的基本程序和结果判读方法。4.学习免疫印迹实验的基本原理，掌握免疫印迹记实验的的基本程序和结果判读方法。PartⅠ.NDV抗血清制备一、实验原理将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体

2、）。由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体（Polyclonalantibody，PcAb）。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。本实验介绍新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）抗血清的制备过程。新城疫病毒（Newcastl

3、ediseasevirus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster2C株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。二、实验仪器、材料和试剂1.仪器15mL无菌冻存管，2.5mL和1mL注射器，塑料静脉插管，碘酒，75％酒精棉球，剪刀，止血钳，250mL无菌三角瓶，50mL无菌尖底离心管，家兔固定槽，家兔解剖台，棉线，5mL吸头和移液

4、器，温箱，离心机。2.材料家兔：1-2kg清洁级雄性或未孕雌免；小鼠：SPF级6-8周龄昆明鼠。3.试剂鸡新城疫病毒Ulster2C株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），0.01MPBS（pH7.2）（8gNaCl，0.2gKCl，2.9gNa2HPO4.12H2O，0.2gKH2PO4，以NaOH调节pH至7.2，加双蒸水至1000mL），麻醉剂：普鲁卡因溶液，硫柳汞。三、方法和步骤（一）NDV兔抗血清制备1.家兔捉拿方法动物的捉拿和固定是进行动物实验的基本操作之一，正确的抓取固定动物是为了不损害动物健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，保证实验顺利进行。家兔习性温顺，除脚爪锐利应避免被其

5、抓伤外，较易捕捉。拿时切忌以手提抓兔耳、拖拉四肢或提拿腰背部。正确的方法是用右手抓住其颈背部皮毛，轻提动物，再以左手托住其臀部，使兔的体重主要落在左手掌心（如图1）。图1.家兔的捉拿方法2.家兔固定方法家兔的固定，依不同的实验需要，常用兔固定箱或兔手术台固定。兔固定箱通常由木头、铁皮或者树脂材料制成，便于拆卸清洗消毒，一般用于固定兔子狐狸貉子等。使用时时可将家兔置于兔固定箱内，在不需要帮手的情况下单人即可对兔子等小动物打耳号，灌药、耳缘静脉注射、取血、或观察耳部血管的变化等，常用于生理、药理和免疫等作动物整体实验时限制实验物的活动。2图2.家兔固定箱固定方法在需要观察血压、呼吸和进行颈、胸、腹

6、部手术时，应将家兔以仰卧位固定于兔手术台上。固定方法是：先以四条1cm宽的布带作成活的圈套，分别套在家兔的四肢腕或踝关节上方，抽紧布带的长头，将兔仰卧位放在兔手术台上，再将头部用兔头固定器固定，然后将两前肢放平直，把两前肢的系带从背部交叉穿过，使对侧的布带压住本侧的前肢，将四肢分别系在兔手术台的木柱上。图3.家兔手术台固定方法3.初次免疫在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择6~10处免疫接种点，采用皮下、皮内或肌肉注射，每点注射上述鸡新城疫病毒Ulster2C株灭活疫苗0.1～0.2mL。如果使用没有加佐剂的灭活新城疫病毒Ulster2C株，也可以采用耳缘静脉注射的方法

7、进行免疫。图4.家兔耳缘静脉注射方法4.二次免疫第一次免疫后间隔2周再以鸡新城疫病毒Ulster2C株灭活疫苗采用与初次免疫相同的方法在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择6~10处免疫接种点，3采用皮下、皮内或肌肉注射加强免疫。5.终末免疫第二次免疫后间隔2周再按上述二次免疫方法进行第三次免疫。6.试血终末免疫免疫7天后经兔耳缘静脉采血2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测