annexin v-fitc-pi apoptosis detection kit细胞凋亡

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1、AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKitwww.vazyme.comVazymeBiotechCo.,Ltdwww.vazyme.com销售/sales:Vazymebiotechco.,ltd.sales@vazyme.com技术支持/technicalsupport:使用说明书support@vazyme.com目录Catalog1/产品概要在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。An

2、nexinV是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的细胞膜结合。因此AnnexinV被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将AnnexinV进行绿色荧光（FITC或EGFP）标记，以标记了的AnnexinV作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能

3、够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（AnnexinV-/PI-）；而右下象限为早期凋亡细胞，显现（AnnexinV+/PI-）；右上象限是凋亡晚期细胞和坏死细胞，为（AnnexinV+/PI+）。2/产品组成组分A211-01(50rxn)A211-02(100rxn)AnnexinV-FITC250µl250µl×2PIStainingSolution250µl250µl×21×Bi

4、ndingBuffer25ml25ml×23/贮藏与保质期本试剂盒所有组分均在4-8°C保存，长期不用可将AnnexinV-FITC放-20°C保存。产品概要产品组成贮藏与保质期实验方案样品染色样品分析www.vazyme.com参考实例：流式细胞仪检测TRAIL诱导的Jurkat细胞凋亡操作注意事项常见问题与解决方案01/024/实验方案6/操作注意事项4.1样品染色1.由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析。1.悬浮细胞：300g,4°C离心5min收集细胞。2.对于贴壁细胞，

5、消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g,4°C离心5min收集细胞。胰酶消化时漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色；处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤间不宜过长，以防引起假阳性。细胞，胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI2.用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在300g,4°C离心5min。收集1~5×105细胞。摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨3.加入100μl1×

6、BindingBuffer重悬细胞。酸与AnnexinV-FITC的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接4.加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPIStainingSolution,轻轻混匀。触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大5.避光、室温反应10min。，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应尽量不用EDTA，EDTA影响AnnexinV与PS6.加入400μl1×BindingBuffer,混匀，样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。的

7、结合。注意：为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。3.实验中如需要固定细胞，比如在检测凋亡的同时检测细胞周期，只能选用AnnexinV-FITC，不能选用AnnexinV-EGFP，因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发4.2样品分析荧光的能力。固定前需要先将细胞与AnnexinV-FITC进行孵育，并用BindingBuffer洗A.流式细胞仪分析：掉未结合的AnnexinV-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加并会产生细胞碎片，可激发波长为488nm；FITC

8、的绿色荧光在FL1通道检测；PI的红色荧光在FL2或FL3以和AnnexinV结合，对结果产生干扰。通道检测，建议使用FL3。用CellQuest等软件进行分析：绘制双色散点图(4.如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与two-colordotplot)，FL1为横坐标，FL3为纵坐标。每个样采集10,000events。典AnnexinV结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDT