体表粘液在赤子爱胜蚓抗菌免疫中的作用

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1、http://www.paper.edu.cn1 体表粘液在赤子爱胜蚓抗菌免疫中的作用* 王冲，孙振钧，郑冬梅，黄健（中国农业大学资源与环境学院，北京100094）* 通讯作者，Email：sun108@cau.edu.cn 摘要：本研究探讨了体表粘液在蚯蚓抗菌生态免疫系统中的作用。结果表明：当浓度为0.2g/mL时，蚯蚓的体表粘液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为1.22厘米；其次为大肠杆菌，抑菌圈直径为1.13厘米，对绿脓杆菌的抑菌作用最差，仅为0.98厘米，诱导后蚯蚓体表粘液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用显著增加，差异极显著（P＜0.01），但对绿脓杆菌的抑菌作用没有显著增加。此外，本

2、研究还从蚯蚓的体表粘液中分离出具有抗菌活力和溶菌活力的凝集素粗品，含糖量为1.66±0.16%，并且在细菌诱导后凝集素的含糖量显著提高，为3.75±0.13%，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活力增强。关键词：赤子爱胜蚓；体表粘液；凝集素；抗菌作用1.引言鱼类和两栖类在长期的进化过程中，为抵御有害环境因子的侵袭逐渐形成了一系列的保护机制。其中，在它们的皮肤分泌液中存在各种各样与机体防御相关的物质，如能杀灭微生〔1，2，3，4，5，6〕物、防御天敌的生物胺和活性多肽等。并且在大肠杆菌诱导蚯蚓后，能够增加表皮中大颗粒粘液细胞和网状细胞的分泌功能，分泌出大量含有粘多糖蛋白液体复合物的粘液，因此蚯蚓的

3、体表粘液也可能在蚯蚓的抗菌免疫系统中发挥着重要作用。本实验对蚯蚓的体表粘液的抗菌特性和蛋白质组成进行了初步分析，并试图从体表粘液中分离纯化出凝集素等活性物质，从而系统的阐明体表粘液在蚯蚓抗菌免疫中可能发挥的作用。2.材料与方法2.1实验材料蚯蚓为本实验室用腐熟的牛粪进行人工饲养的赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）。大肠杆菌、绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌均从中国科学院微生物所菌种保藏室购买，实验室扩繁后保存。体表粘液的获得：选取成熟蚯蚓（有生殖环，平均重量 0.3－0.5克）若干，放置在干净的容器中，加适量生理盐水，15 分钟后吸取粘液，于4℃10000r/min离心 30 分钟，取上清液，

4、即为蚯蚓的体表粘液，冷冻干燥后备用。2.2蚯蚓体表粘液的抑菌实验2.2.1细菌诱导的实验方法LB液体培养基的配制：950 毫升重蒸水、10 克蛋白胨、5 克酵母浸粉、10 克氯化钠，1本课题得到中国高校博士点基金（20020019029）；国家自然科学基金(30470220)资助。1 http://www.paper.edu.cn[7]溶解后用 5M的氢氧化钠调 pH 值至 7.0，加水至 1 升，100Pa灭菌 20 分钟。细菌诱导：按 Sumida等（1992）方法将大肠杆菌进行对数期培养。即将大肠杆菌接种于 5mlLB液体培养基上，37℃摇动过夜培养，将 0.2ml 菌液加到 5ml 新

5、的 LB液体中，同样[8]的温度下摇动 2 小时，此时的菌液即为对数生长期的大肠杆菌液。再将对数期生长的大肠5杆菌液稀释到 1×10 个细菌/毫升后，把蚯蚓放在其中浸浴 4 小时。2.2.2抑菌实验将10ml 已高压灭菌的并冷却至50℃左右的LB培养基倒入9cm 培养皿中，然后将5mLLB培养基与 200μl 对数生长期的菌液快速混合均匀，加入到已经铺有 10mLLB培养基的培养皿中。4℃冰箱过夜。第二天在培养皿中放入3 个牛津杯。分别在牛津杯中加入100 μl 浓度为 0.2克/毫升经 0.22 微米滤膜除菌的，诱导前后的体表粘液，同时设生理盐水对照。培养皿于4℃放置8 小时后35℃恒温培养

6、24 小时。测量抑菌圈直径同时拍照。（注：细菌的操作都在无菌操作台里进行）。2.2.3最小抑菌浓度（MIC）的测定按照陈秀枢(1994)的方法，用LB液体培养基将0.2 克/毫升，诱导前后的体表粘液分别做2 倍系列稀释，浓度分别为0.2g/mL、0.1g/mL、0.05g/mL、0.025g/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL、1.5625mg/mL、0.78125mg/mL和 0.39625mg/mL。在 96 孔板上每孔依次分别加入不同质量浓度的体表粘液50μL 以及菌液50μL。35℃孵育20～22h 后，加入0.5%的2.3.5氯化三苯基四氮唑（TTC）

7、5μL，继续孵育1～3h，培养孔呈现红色为〔9〕有细菌生长。结果判断以无可见细菌生长的最低药物浓度为EC对测试菌的最小抑菌浓度。2.3蚯蚓体表粘液蛋白质组成的初步分析[10]采用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法对诱导前后体表粘液的蛋白质组成做初步分析。分离胶浓度为 15%，浓缩胶浓度为5%。样品的上样浓度为 1mg/mL，上样量为 10μl。用分子量为 45kDa、30kDa、20.1kDa、14.3