资源描述：
《双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cdna序列拼接和分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、双脱氧末端终止法测序的原理、过程和目标基因序列的分析教师：程琳2011年11月分子生物学实验1实验目的1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原理，掌握DNA测序的基本方法；2、学会序列查询、核酸及蛋白质的同源性搜索和比对。2DNA测序技术主要有两种方法，都是在20世纪70年代中期发明的。A.双脱氧链终止法（thechainterminationmethod），是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的顺序。B.化学降解法（chemicaldegradationmethod），是将双链DNA分子用化学试剂处理，产生切口，用同位
2、素标记进行测序。一、DNA测序的方法31.Sanger双脱氧链终止法测序原理利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F.Sanger等人于1977年发明的。4基本原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子；利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端。因为ddNTP3’不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。562、具体操作：测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A
3、,C,G,T核苷三磷酸（称为ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP）,然后进行聚合反应。在第一个反应中,ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H,所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了。7同理第二个反应产生的都是以C结尾的;第三个反应的都以G结尾,第四个反应的都以T结尾,电泳后就可以读出序列了.8假如有一个DNA,互补序列是GATCCGAT,我们试着做一下:在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP,所以遇到G,T,C三个碱基时没什么问题,
4、但遇到A时,掺入的可能是dATP或ddATP,比如已合成到G,下一个如果参与反应的是ddATP则终止,产生一个仅有2个核苷酸的序列:GA,否则继续延伸,可以产生序列GATCCG,又到了下一个A了.同样有两种情况,如果是ddATP掺入,则产生的序列是GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生GATCCGAT.将得到如下结果：1产生的都是以A结尾的片段:GA,GATCCGA。234产生的都是以C结尾的片段:GATC,GATCC产生的都是以G结尾的片段:G,GATCCG产生的都是以T结尾的片段:GAT,GATCCGAT9制得的四组混合物全部平
5、行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。即可得到测序结果：为GATCCGAT10制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列3、技术路线：114、高通量自动化测序DNA序列分析自动化包括两个方面的内容，一方面是指“分析反应”的自动化，另一方面是指“读片过程”的自动化。自动化的DNA序列分
6、析，也是根据Sanger双脱氧链终止DNA测序法的基本原理发展起来的。12自动化测序原理自动化测序类似于PCR反应，但只用一条引物，反应混合物中含有不同荧光标记的ddNTP与4种dNTP。由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基。产物条带经过检测仪时给出特定信号，由计算机判读并记录。优点：可用双链DNA做模板；模板用量少，不必克隆；可实现高通量自动化。13高速自动DNA测序仪的结构及工作原理由激光发射器产生的激光束，通过精密的光学系统后被导向凝胶表面的检测区。在此，激光束垂直射向凝胶，同经过检测孔的DNA片
7、段发生作用，并提供能量激发荧光发色基团发射出具特异性波长的荧光。这些荧光通过聚焦镜集中后传给滤光镜/棱镜组件，以便四种碱基产生的不同标记波长区别开来。经成像透像最后由高灵敏度的相机分段收集信号，传送给计算所分析处理。14荧光化合物标记链终止法以荧光颜色为标记信号，每种ddNTP各有1种代表颜色；整个反应在一个试管中进行；当新合成的终止单链通过荧光监测仪时，可由光信号读出末端核苷酸并由电脑记录。1516Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力：手工测序：最大约300bp；自动测序：最大约1200bp。17二、序列比对分析1.相似性与同
8、源性相似性(similarity)：是指一种很直接的数量关系，比如部分相同或相似的百分比或其它一些合适的度量。比如说，A序列和B序列的相似性是80％，或者4/5。这
