叶绿素荧光分析技术与应用

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1、叶绿素荧光分析技术与应用激发能光化学反应形成同化力热耗散荧光荧光的发生CO2固定光呼吸Mehler反应N代谢荧光是研究光能分配的探针将绿色植物或含叶绿素的部分组织，如叶片、芽、嫩枝条、茎或单细胞藻类悬液放在暗中适应片别，或用近红外光预照射，然后在可见光下激发，并用荧光计检测，结果就会发现植物绿色组织会发出一种微弱的暗红色强度随时间不断变化的荧光信号，这过程称为植物体内叶绿素a荧光诱导动力学，简称为叶绿素荧光动力学。由于这个现象最早是由Kautsky发现的，因此有时也被称为Kautsky效应。现已探明，在室温条件下，绿色植物发出的这种荧光信号，绝大部分是来自叶绿体光系统II(PSII)的天线色素

2、蛋白复合体中的叶绿素a分子，荧光发射波长范围约在650－780nm，荧光发射峰在685nm和735nm，其荧光激发光谱与叶绿体的吸收光谱近似，荧光激发峰在438nm与480nm左右。叶绿素荧光诱导动力学是指经过暗适应的绿色植物材料当转到光下时，其体内叶绿素荧光强度会有规律的随时间变化。根据现在国际上的统一命名，可把荧光诱导曲线(图1)划分为：O(原点)→I(偏转)→D(小坑)或pl(台阶)→P(最高峰)→S(半稳态)→M(次峰)→T(终点)这几个相(phase)。有时在O和I之间还可辨认出一个扔点称为J相。其中O→P相为荧光快速上升阶段(1－2s)，从P→T为荧光慢速下降(猝灭)阶段(4－5s

3、），在此阶段，往往出现复杂的情况，有时没有M峰，有时出现几个渐次降低的峰，因叶片的生理状态不同而异。一般而言，遭受环境胁迫的叶片M峰消失，而生理状态良好的叶片往往在P峰之后有几个峰出现。这可能反映了同化力形成和使用之间从不平衡到平衡的一个快速的调节过程。叶绿素荧光诱导动力学OIDPSMT曲线经暗适应的绿色植物样品突然受到可见光照射时，体内叶绿素分子可在纳秒(ns)级时间内发出一定强度的荧光，此瞬时的荧光诱导相位称为初相或“O”相，此时的荧光称为固定荧光(F。)，然后荧光强度增加的速度减慢，因而在Fo处形成拐点，接着以毫秒级速度形成一个缓台阶，称为“I”相和“D”相，数秒后荧光强度可达最高点，称

4、为“P”峰。若所用激发光强度达到或超过被测样品光反应的光饱和点时，P峰即趋于或等于最大荧光(Fm)。荧光强度超过Fo那一部分的荧光称为可变荧光(Fv)。在P峰之后，植物荧光通常经1－2次阻尼振荡(称较大峰“M1”和“M2”)，才降到接近Fo的稳定的“T”相终水平。荧光强度下降的过程现称为荧光猝灭。根据植物材料和暗适应时间的不同，上述荧光诱导动力学过程要延续3—6分钟左右。叶绿素荧光动力学的测量可采用调制式与非调制式两种不同方法。非调制式荧光计的结构比较简单，它仅需要一个强连续光源，此光源既作为激发光，又作为测量光，但是为了能够捕捉到植物荧光信号上升前沿中的拐点，要求整个系统的时间分辨率达到毫秒

5、(ms)级。在光源与样品之间，通常加有蓝色的长波截止滤光片和毫秒级电子快门。现在国外也有用亮度较大的发光二极管作为光源的，由于发光二极管光源的上升前沿较快，这样就可省去电子快门。光电转换接收器可用光电倍增管或光电三极管，它们的光谱响应要选择与植物荧光发射波长范围相吻合。在接收器之前通常加有红色的短波截止滤光片，以完全滤掉激发光。毫秒级记录设备可用瞬态记录器、记忆示波器或带有A/D转换的计算机等。在控制电子快门与记录荧光信号之间要有一个同步触发装置或同步程序，以保证取样和记录过程与电子快门动作相同步。为了减少样品对荧光的重复吸收，通常是把接受器与入射的激发光安排在样品的同一侧。叶绿素荧光动力学的

6、测量方法TechnicalSpecificationsItemssupplied:Controlunit,remotesendingunit,10darkadaptionleafclips,4AAbatteries,carryingcase,serialcable,downloadingsoftwareandinstructionmanual.Measuredparameters:Fo,Fm,Fv,Fv/Fm,Ft,T1/2Excitationsource:Solidstate685nmsource.Adjustableintensity:500-3000molmsDetectorsandfi

7、lters:APINphotodiodewithanIRfilterTestduration:Adjustablefrom2-240seconds.Samplingrate:40Kpointspersecondforfastkineticsforonesecond;switchingto500pointspersecondfortwosecondsandthenswitchingto10point