A型与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒嵌合基因在家蚕杆状病毒载体中的表达.pdf

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1、一28一江苏农业科学2012年第40卷第9期刘航，田永强，张韵，等．A型与亚洲I型口蹄疫病毒嵌合基因在家蚕杆状病毒载体中的表达[J]．江苏农业科学，2012，40(9)：28—31A型与亚洲I型口蹄疫病毒嵌合基因在家蚕杆状病毒载体中的表达刘航，田永强，张韵，李志勇，柳纪省(1．中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室／家畜疫病病原生物学国家重点实验室／农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃兰州730046；2．兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃兰州730070)摘要：口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进A型口蹄疫病毒(FMD

2、V)基因工程活载体疫苗的研制，选取A型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体一2A基因中的VP1和VP3以及亚洲I型蛋白酶3c基因，插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中，构建重组载体pVL—P／一2A3C，并与线性化病毒Bm—BacPAK6DNA共转染家蚕BmN细胞，获得重组病毒Bm—P／一2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫，以双抗体夹心ELISA法检测血淋巴中的表达产物，结果显示目的蛋白在感染病毒后108h的蚕血淋巴中表达量最高，A型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1024，而亚洲I型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为2048。结果表明A型

3、和亚洲I型FMDV的一2A3C基因已在家蚕体内获得表达。关键词：A型口蹄疫病毒；基因工程疫苗；P1—2A3C基因；家蚕杆状病毒表达系统中图分类号：$852．65文献标志码：A文章编号：1002—1302(2012)09—0028—04口蹄疫(foot—and—mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病得到高效表达。毒(foot—and—mouthdiseasevirus，FMDV)引起的一种急性、1材料与方法热性、高度接触性传染病，具有传播迅速、感染率高等特点，被OIE列为A类家畜传染病之首⋯。FMDV属于小RNA病毒1．1病毒和细

4、胞系科口蹄疫病毒属，病毒基因组为单股正链RNA，约由8500个A型FMDV由中国农业科学院兰州兽医研究所分离、保核苷酸组成，有7个血清型，各型间无交叉免疫保护。口蹄存，在BHK一21细胞中繁殖。亚洲I型家蚕杆状病毒表达系疫P1编码区决定着病毒的抗原性和血清型，是研究分子流行统的转移载体(pVL—P／一2A3C)、DHIOB、亲本病毒Bm—病学、毒株演化关系和基因工程疫苗的基础。。￡基因、2BacPAK6、BmN细胞、供试家蚕品种JY1由中国农业科学院蚕基因、3C基因是编码FMDV的3种主要蛋白水解酶基因，在业研究所保存。BmN细胞用含1

5、0％胎牛血清的TC一100培养多聚蛋白的裂解及病毒衣壳的组装过程中发挥重要作用-o。基在27℃下进行培养，用于Bm—BacPAK6和重组病毒繁殖。其中，3c蛋白酶的作用尤为重要，在11个蛋白酶裂解位点RNA提取试剂盒购自Qiagen公司，工具酶为Promega公中，有9个位点是由3C蛋白酶完成的裂解过程。病毒结司产品，脂质体lipofectamine2000购自Invitrogen公司，A型构蛋白前体P1只有经3c蛋白酶裂解，才能产生成熟的病毒口蹄疫ELISA检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研抗原。病毒结构蛋白前体P1中的主要抗原位

6、点都在VP1、究所。引物由上海生工生物工程有限公司提供。VP3上。基于3C蛋白酶参与P12A前体的裂，有利于暴露1．2A型与亚洲I型口蹄疫病毒嵌合基因重组杆状病毒转抗原位点，所以本试验选取了A型的VP1、VP3和亚洲I型的移栽体的构建2A、3C组合基因的表达，希望能在家蚕杆状病毒表达系统中1．2．1A型口蹄疫病毒VP1和VP3的扩增按Qiagen公司RNA提取试剂盒的说明，从A型口蹄疫病毒细胞培养液中提收稿日期：2012—02—19取RNA。将提取的总RNA用Oligo(dT)18引物在AMV反转作者简介：刘航(1984一)，男，辽宁葫

7、芦岛人，硕士研究生，研究方录酶的作用下，42℃反转录制备eDNA，以获得的cDNA为模向为动物传染病与分子病毒学。E—mail：liuhang77@163．COIn。板，用特异性引物进行PCR扩增。以A型的pVL1393一一通信作者：柳纪省，研究员，博士生导师，主要从事动物传染病与分子全基因组DNA为PCR模板，设计引物：VP3上游为5一病毒学研究。E—mail：liujixing@hotmail．coin。ITACACGTGGCGATrGTCCCGGTrGCAT一3(引入PmaCI酶(上接第27页)latoryelementswith

8、int}lepromoterofthetobaccolatepollengeneD347：737—741．[J]．PlantMolecularBiology，2001，45(5)：577—585．[6]Ma