教学讲稿生物大分子

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1、实验室:一教楼388生物大分子的分离与纯化制作者：李辰范子寒郭泽吴蒙甘惠仁生物大分子定义：生物体内结构具有一定的规律性，由基本结构单位按一定顺序和方式连接而形成的多聚体称为生物大分子。其分子量一般大于10000。主要包括：蛋白质和核酸其分离纯化的一般程序材料的预处理破碎细胞及提取生物大分子（有时还需要进行细胞器的分离）分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离纯度鉴定其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。蛋白质核酸步骤1、材料的及3、蛋白质粗制品的获得4、1、材料预处理及细胞破碎2、NaCl溶液提取核蛋白3、有机溶剂除蛋白DNA酶除DNARNA酶除RNA4、沉淀

2、，精细提取5、分离纯化蛋白质核酸提取纯化的一般步骤预处理细胞破碎蛋白质的提取2、核酸的粗提取样品的进一步分离纯化5、纯度鉴定6、纯度鉴定一、材料的预处理动物材料需要除去与实验无关的结缔组织、脂肪组织植物种子需要除壳微生物需要将菌体与发酵液分开P.S.必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。二、细胞的破碎（细胞器的分离）生物大分子的分离要求其从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎通常我们使用玻璃匀浆器若材料是体液（如血液）或生物体分泌到体外的分泌物，则

3、不必进行组织细胞的破碎。p.s.组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。p.s.细胞器的分离目的：防止其他细胞组分中的物质对制备物(细胞器中)的干扰或污染一般方法：差速离心法常用的介质：蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等三、提取目的：从组织细胞破碎后的释放液中分离出制备物手段：借制备物与其他物质对溶剂的溶解度不同来分离出制备物种类：据实验方法的不同分为蛋白质的提取和核酸的提取p.s.保持适合的条件、动作要快避免因长久放置造成制备物的分解破坏蛋白质（酶）的提取原理：大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中,

4、故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主生理条件下的缓冲液:20-50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）0.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.5-8.0）p.s.对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质和酶，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。核酸的提取DNA和RNA在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。DNP的提取一般是利用DNA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/LNaCl溶液而不溶于0.14mol/LNaCl溶液。RNP的提取RNA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/LNaCl溶液而不溶于1m

5、ol/LNaCl溶液除去蛋白在DNP或RNP中加入有机溶剂(苯酚等)溶解蛋白四、分离纯化这一阶段一般分为两步：粗分级分离细分级分离蛋白质（酶）的分离纯化根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度等，有以下方法可以分离：性质方法分子大小透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤溶解度等电点沉淀、盐析、有机沉淀剂沉淀电荷电泳、离子交换层析对配体分亲和层析子的生物亲和力1、粗分级分离方法：盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀目的：使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开特点：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。（1）盐析(分段盐析)方法：向蛋白质溶液中加

6、入大量的中性盐[（NH4)2SO4，Na2SO4，Na2SO4]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。作用：破坏蛋白质分子表面的水化层,中和蛋白质的电荷。分段盐析不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：血清(NH4)2SO4饱和清蛋白析出球蛋白析出半饱和(NH4)2SO4等电点沉淀原理：蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质有不同的等电点，

7、因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。（3）有机溶剂法与水互溶的有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。有机溶剂引起蛋白质沉淀的原因有两个：降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。极性有机溶剂与蛋白质争夺水化膜，而使蛋白质分子沉淀。低温有机溶剂法：室温下，有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，可在很大程度上解决变性问题。有机溶剂浓度

8、的影响：不同的蛋白质由于