B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白调控细胞凋亡的比较研究-论文.pdf

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1、·344·中华实验和临床病毒学杂志2013年10月第27卷第5期ChineseJExpClinVirol，October2013。Vo1．27。No．5．论著B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白调控细胞凋亡的比较研究明月，谢奇峰，杨林【摘要】目的探讨B、C基因型HBVX蛋白(HBx)对肝癌细胞凋亡的影响方法采用PCR法扩增B、C基因型HBVX基因片段，并定向插入绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体构建重组体pGFP-XB及pGFP—XC；使用FugeneHD将载体pEGFP—C1、pGFP—XB及pGFP—XC转染Bel-7402细胞，RT—PCR及West

2、ernBlot鉴定HBVX基因的转录与表达，以建立稳定表达细胞株Bel-7402／GFP、Be1．7402／GFP—XB、Bel一7402／GFP—XC，用阿霉素(2．5g／m1)分别处理上述细胞，处理后用锥虫蓝染色法和流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果RT—PCR及WesternBlot检测显示在Bel一7402／GFP．XB、Be1．7402／GFP—XC有HBVX基因转录与表达。锥虫蓝染色检测表明阿霉素处理的Bel一7402、Be1．7402／GFP细胞发生了明显的时间依赖性死亡，而在Bel-7402／GFP—XB、Bel一7402／GFP—X

3、C和未加阿霉素处理的空白对照组细胞未见明显细胞死亡；流式细胞术检测显示阿霉素处理48h后，Bel-7402／GFP—XB、Bel-7402／GFP—XC细胞的凋亡率分别为3．87％、4．01％，两者差异无统计学意义(P>0．05)，且与未处理的空白对照组细胞凋亡率(2．74％、2．91％、3．00％、2．83％)差异无统计学意义(P>0．05)，但明显低于加入阿霉素处理的Be1—7402细胞(27．05％)及Bel·7402／GFP细胞(29．14％)(P<0．01，。结论成功建立了稳定表达B、C基因型HBVX与GFP融合蛋白的人肝癌细胞系，为进一步

4、研究HBVX的生物学功能提供了基础。在人肝癌细胞，B、C基因型HBVX蛋白均能抑制阿霉素诱导的细胞凋亡，其抑制细胞凋亡的作用无明显差异。【主题词】肝炎病毒，乙型；基因型；细胞凋亡；癌基因蛋白质类，病毒性ThecomparativestudyontheregulationofapoptosisbyhepatitisBvirusXproteinbetweenBandCgenotypeMlNGYue。XlEQi．feng，YANGLin．’PanyuCentralHospital，Guangzhou511400，ChinaCorrespondingauth

5、or：XIEQi-feng，Emaif：txilan@163．tom【Abstract】0bjectiveToinvestigatetheapoptosisregulationonhepatomacellsbyHBxbetweengenotypeBandC．MethodsGenotypeBandCHBxgenefragmentswereamplifiedandinse~edintogreenfluorescentprotein(GFP)eukaryoticexpressionvectorpEGFP—C1toconstructrecombinantpG

6、FP．XBandpGFP—XC．ThepEGFP．C1．pGFP，XBandpGFP—XCwereintroducedintoBel一7402cellsbyFugeneHDtoobtainBel-7402cellsexpressingGFP．ThetranscriptionandexpressionofHBxgeneweredemonstratedbyRT—PCRandWesternBlotanalysis．Bel-7402，Be1．7402／GFP，Bel-7402／GFP—XB．Bel-7402／GFP．XCcellsweretreatedwit

7、hadriamycin(2．5g／m1)，andtheapoptosisofthecellswasdeterminedbyt~panblueexclusion．andflowcytometryanalysis．ResnltsRT—PCRandWesternBlotanalysisshowedthatHBxgenesofgenotypesBandCweretranscribedandexpressedinBel一7402／GFP．XB．Be1．7402／GFP—XCcells．Trypanblueexclusionshowedadriamycinind

8、ucedtime．dependenteelldeathinBel一7402．Be1．7402／GFPcell