硫酸盐还原菌杀菌实验 (瓶试法).doc

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1、硫酸盐还原菌杀菌实验一、方法提要MPN法-测试瓶法，在35℃（或实际水养环境温度下）培养7天。二、硫酸盐还原菌生长显示特征硫酸盐还原菌测试瓶中的液体变黑、有黑色沉淀或铁钉变黑，均表示有硫酸盐还原菌生长。三、试验仪器和设备1、生化培养箱2、无菌注射器：1mL3、SRB—HX测试瓶（七天）4、100mL试剂瓶。四、实验前的准备1.准备好所需无菌注射器和测菌瓶；2.待检测的现场水样（或驯化好的SRB富集液—其获得见“五-1-菌种的制备”）。五、测定步骤1、菌种的制备一般采用现场取得含菌水样作为待用的菌悬液。当没有现场水样或水样不足时，可采用以下方法进行SRB的富集液培养：（1

2、）向SRB测试瓶（9mL规格，如北京华兴化学试剂厂产的SRB-HX型细菌测试瓶）中注入1ml含SRB菌种的水样，可根据需要量做多个平行瓶；（2）将注菌的SRB测试瓶于恒温培养箱中合适温度（最好与现场待测水样温度一致，误差可为±5℃）下培养4～7天；如果测试瓶发黑则表明培养成功；然后放入冰箱（4℃）内，作为菌种保存备用。（3）在实验的前一天需在使用原培养温度下活化培养3-5小时，作为制备菌悬液之用。当然，SRB富集液的培养也可采用更为复杂的自制培养基进行驯化培养，但由于相对测菌瓶而言比较费时复杂，一般情况下采用以上方法即可。2、菌悬液的制备取现场水样为试验用菌悬液。如果现

3、场水样菌数不足或因存放过久没有细菌可如下操作获得菌悬液：将冰箱内驯化的富集液在使用原培养温度下活化培养3-5小时，然后用滤纸过滤，按照菌种：现场水样=1：20～200比例（根据需要的空白菌数选择相应的稀释），加入至现场水样中，搅匀后即可作为菌悬液使用。3、药剂的配制将被检测药剂配成10mg/mL（1%）水溶液。（可根据具体的检测要求具体配制药剂浓度）4、7、试样菌药接触培养取100mL菌悬液加入试剂瓶中，再加入规定浓度药剂后，密封放入生化培养箱中35℃（或实际水养环境温度下）培养接触4h（可根据具体实验规定接触培养时间），待测。同时做空白对照样。8、试样的稀释和接种（1

4、）用10倍稀释法稀释水样，即用无菌注射器取1mL待测样注入SRB-HX测试瓶中，充分摇匀，此时稀释度为10-1。（2）另取一支无菌注射器取稀释度为10-1的水样1mL注入到第二个SRB-HX测试瓶中，充分摇匀，此时稀释度为10-2，以此类推，直至需要的稀释度为止。（3）每个稀释度作2-5个平行测试瓶。每接种一个稀释度更换一支无菌注射器针管。（4）加药试样的操作相同，最后的稀释度可以比空白试样少1-2次方。9、培养将稀释好的SRB-HX测试瓶充分摇匀，置于生化培养箱中在规定温度下培养7天。六、计数与报告（1）凡测试瓶中的液体变黑、有黑色沉淀或铁钉变黑，均表示有硫酸盐还原菌

5、存在，以“+”（阳性）表示，其余测试瓶以“-”（阴性）表示。（2）算出10进位稀释测试瓶中阳性试剂瓶数，以阳性组合指数记录下来。（3）在10进位稀释中多于三个稀释度时，阳性组合的指数只需要用其中依次的三个稀释度，对这三个稀释度的决定是先选出5瓶全部阳性反应的最大稀释度，然后选出其次相连的两个更高的稀释度，算出阳性组合指数。（见表格1例1、2、4）（4）若按照上条规定的原则选出三个稀释度后，有更高的稀释仍然产生一个阳性试剂瓶，就应将这一阳性试剂瓶并入所选择的最高稀释的阳性结果中。（5）根据阳性组合的指数，查阳性组合指数与菌数的对应关系表计算出对应菌数。七、分析结果表述以百

6、分数表达杀菌率X按照公式（1）计算：A-BAX=×100%…………………………………(1)式中：A—空白对照样的菌数；B—加药试样存活菌数。