小鼠肝炎病毒A59毒株结构蛋白基因的克隆-论文.pdf

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1、AnimalHusbandry＆VeterinaryMedicine2014Vo1．46No．8小鼠肝炎病毒A59毒株结构蛋白基因的克隆陈晓娟，卫振，刘迪文(浙江大学实验动物中心，浙江杭州310058)摘要：为获得小鼠肝炎病毒(mousehepatitisvirus，MHV)结构蛋白基因s1、s2、M及N，分别构建了4个重组质粒。依据GenBank公布的MHVA59毒株RNA全序列设计4对特异性引物，以A59RNA反转录得到的eDNA为模板，通过PCR扩增出Sl、s2、M及N这3个结构蛋白基因的4个片段，分别将其通过A—T连接入pMD一20

2、T载体后，双酶切鉴定正确后，送出测序确认。将测序结果与GenBank序列比对，确认扩增得到的s1、s2、M及N的核酸序列与其相似度分别为100％，99％，100％和99％。试验成功扩增出s1、s2、M及N的核酸序列，其构建的重组质粒可以作为检测MHV的阳性对照，为建立RT—PCR快速检测试验小鼠MHV的方法提供生物材料。关键词：小鼠肝炎病毒；RT～PCR；克隆中图分类号：$852．6文献标志码：A文章编号：0529-5130(2014)08-0080—03小鼠肝炎是实验小鼠常见的传染病之一，其病原只能在P2生物安全实验室进行操作，这就限制了

3、一体小鼠肝炎病毒(mousehepatitisvirus，MHV)多呈般实验动物饲养管理机构对MHV日常检测方法的建隐性或亚I临床感染，但严重干扰小鼠试验结果的准确立J。本试验以MHVA59毒株的RNA为模板，设性，是清洁级及以上动物必须排除的微生物，也是国计了4对特异性引物扩增s1、s2、M和N蛋白的基标规定的实验大小鼠必检项目。小鼠肝炎病毒在分类因序列，并分别构建重组质粒，避免直接使用病毒作上属于冠状病毒科冠状病毒属的单股正链RNA病毒，为阳性对照样品的危害性，为早期快速诊断MHV建基因组大小约31kb，包括3个主要的结构蛋白，即立安全

4、、敏感、可靠的检测方法打下了基础。s蛋白、M蛋白和N蛋白⋯。s蛋白(刺突糖蛋白)1材料与方法约1300个氨基酸，构成病毒胞膜上的突起部分，以第717氨基酸分为2个部分，即Sl和S2。S1较易变1．1病毒RNA化，位于蛋白的氨基端，形成一个球状结构，含有受A59小鼠肝炎病毒RNA由上海市实验动物质量体结合位点；s2相对保守，位于蛋白的羧基端，形监督检验站馈赠。成一个穿膜的棒状结构，含有3个螺旋结构j。M1．2主要试剂蛋白(膜糖蛋白)约230个氨基酸，分信号肽、膜MiniBESTUniversalRNAExtractionKit、RT-PCR外

5、区、跨膜区、胞外区等5个功能区。N蛋白(核衣Kit、PrimeSTARHSDNAPolymerase、DNAA—Tailing壳蛋白)约450个氨基酸，与基因组RNA特异性结Kit、T—VectorpMD一20、DNALigationKit、MiniBEST合，位于病毒颗粒的核心。PlasmidPurificationKit、NdeI、SacI(均为TaKaRa目前，实验室诊断MHV主要是ELISA等检测特产品)，DH5oL感受态(北京全式金)。异性抗体，但动物感染病毒后需经过一段时间才能产1．3引物设计生抗体，导致检测的滞后性，不能及时反

6、映机体携带根据GenBank中MHVA59全基因序列病毒情况，造成结果误判。此外，样本量较少时检测(AY700211．1)[93，用PrimerPremier5．0软件设计4抗体会增加经济成本，不利于日常检测。与此相比，对引物，见表1。引物由上海英潍捷基(上海)贸易RT—PCR技术以其快速、准确、样本量小等优点，成有限公司合成。为目前微生物检测的研究热点。MHV核酸检测多以1．4eDNA模板制备其标准毒株作为阳性对照特异性检测结构蛋白的部分RNA测定浓度后，进行eDNA制备。反转录体基因片段，由于病毒培养和提取的特殊性，以致于其系：MHV总

7、RNA1Ixg，5×PrimeScriptbuffer4L，PrimeScriptRTenzymemixI1IxL，OligodTPrimer(50收稿13期：2014—06—16~mol／L)1L，Random6mers(100i~mol／L)1IxL，作者简介：陈晓娟(1983一)，女，助理实验师，硕士加RnasefreedHO至20L。混匀后置于42℃水浴1通信作者：刘迪文，研究员，主要从事实验动物研究、管理及h，85℃5min，冰浴冷却备用。教学工作，E—mail：liudiwen2004@163．son·82·AnimalHusb

8、andry&VeterinaryMedicine2014Vo1．46No．840470480《Y皇0ZAT00：§§00AQ窘警A§A0￡鬣S蕊。s蠢箴￡芏毽毽蕊ATS图3N基因