氨基树脂固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶的研究.pdf

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1、亿亏与生物互程2014，Vo1．31No．09囡Chemistry&Bioengineeringdoi：10．3969／j．issn．1672—5425．2014．09．005氨基树脂固定化S一腺苷甲硫氨酸合成酶的研究尹春丽。曹珊珊。许乐，陶贵荣。牛卫宁。(1．西安文理学院生命科学系，陕西西安710065；2．西北工业大学生命学院，陕西西安710072)摘要：以氨基树脂为载体对S一腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶进行固定化。优化了酶的固定化条件并对固定化酶的性质进行了研究。优化的固定化条件为：戊二醛体积分数5、SAM合成酶添加

2、量20mg·g～、固定化时间5h。所制备的固定化SAM合成酶的酶活力为476．8U·g～，酶活力回收率为74．5％。与游离SAM合成酶相比，固定化SAM舍成酶的稳定性大幅提高，在5O℃孵育5h酶活力仍保留61．2，而游离SAM合成酶则完全失活；在pH值为6．0～6．5、8．0～9．5的缓冲溶液中，固定化SAM合成酶也更加稳定；固定化SAM合成酶连续催化反应10批次，酶活力保留86．3；固定化SAM合成酶在4℃储存30d，酶活力保留81．4％。固定化SAM合成酶米氏常数K=0．14mmol·L_。，K=0．28mmol·L_

3、。。关键词：S一腺苷甲硫氨酸合成酶；氨基树脂；固定化酶；酶学性质中图分类号：Q814．2文献标识码：A文章编号：1672—5425(2Ol4)o9—0017-04S一腺苷甲硫氨酸(S—adenosylmethionine，SAM)作的性质进行了研究，以期开发适用于工业化应用的固为药品和保健品已得到广泛应用[1屯]，其制备方法主要定化酶，为酶法工业化生产SAM奠定基础。有酵母菌发酵法和体外酶促转化法。与酵母菌发酵法1实验相比，体外酶促转化法合成SAM具有生产周期短、底物转化率高、纯化工艺简单以及环境友好等优点，具有1．1菌种

4、、材料与试剂良好的工业化应用前景[=I]。目前，体外酶促转化法合重组大肠杆菌E．coliJM109(pBR322一SAMS)，成SAM需要解决的关键问题是大量廉价SAM合成本研究室构建lu4]。酶的获得以及选择合适的载体固定化SAM合成酶，苯基琼脂糖凝胶预装柱(Phenyl—SepharoseFast以大幅提高固定化酶的稳定性和重复使用批次。Flow)，美国GE公司；SepliteLX一1000HA型氨基树作者在前期研究中构建了组成型表达SAM合成脂，西安蓝晓科技有限公司。酶的重组大肠杆菌[4]，并对SAM合成酶进行了固定

5、S一腺苷甲硫氨酸(SAM)标准品，美国Sigma公化研究。结果表明，通过海藻酸钙包埋法和壳聚糖一戊司；其余试剂均为分析纯。二醛交联法得到的固定化酶的机械强度较低，重复使1．2SAM合成酶液的制备用过程中容易破碎[5。]。而Luo等[8使用镍离子亲和SAM合成酶的表达和纯化参照文献[11]进行，步层析介质固定的酿酒酵母SAM合成酶也存在酶活力骤如下：回收率低以及固定化酶重复使用批次少等不足。大肠杆菌E．coliJM109(pBR322一SAMS)在含有氨基树脂作为一种人工合成的多聚物，具有机械15g·mL四环素的LB培养基中

6、30℃过夜培养至强度高、酶载量大等优点，已经被广泛用作固定化酶载稳定期，离心收集菌体并超声破碎细胞，破碎上清液加体[9。作者使用氨基树脂载体对SAM合成酶进行入0．75mol·L-1硫酸铵进行盐析沉淀；离心后上清了固定化研究，优化了酶的固定化条件并对固定化酶液再经过苯基琼脂糖凝胶预装柱疏水层析，缓冲溶液基金项目：国家自然科学基金资助项目(20802057)．陕西省科技攻关计划项目(2014K10一l3)，陕西省自然科学基金资助项目(2014JQ2063)收稿日期：2014—06—16作者简介：尹眷丽(1977一)。女，山西

7、阳泉人．博士．讲师．主要从事天然产物研究；通讯作者：牛卫宁，博士。副教授，E-mail：niuwein—ing@nwpu．edu．cn。尹春丽等：氨基树脂固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶的研究／2014年第9期(50mmol·LTris—HC1，PH值8．0)洗脱得到SAM酶酶活力及酶活力回收率达到最大值。戊二醛体积分合成酶液，酶活力为32U·nag一。数与氨基树脂表面醛基的含量正相关，树脂表面偶联1．3SAM合成酶的固定化的醛基较少时，固定的酶量不足，导致固定化酶酶活力去离子水洗涤氨基树脂3次，加人不同体积分数较低；偶联的醛

8、基过多时，可导致SAM合成酶变性。的戊二醛水溶液，室温振荡交联5h，去离子水充分洗因此，最佳戊二醛体积分数为5。涤交联载体；然后加入适量纯化的SAM合成酶液，在2．1．2酶添加量(酶与树脂的比例，mg·g～，下同)室温(25¨C，下同)下吸附交联，弃去上清液，去离子水对SAM合成酶固定化的影响洗涤3次，