基因工程载体 3.2

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1、第二章基因工程载体vectors1.基因工程载体的概念把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫载体。作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。Tvector的克隆过程AATTTvectorPCRproductT4DNAligaseAA（1）在宿主细胞内能独立复制。（2）有选择性标记。（3）有一段多克隆位点。2.基因工程对载体的要求外源DNA插入其中不影响载体的复制。（4）分子量小，拷贝数多。3.载体的种类按工作方式:质粒载体、噬菌体载体。按

2、功能:克隆载体和表达载体。按受体细胞:原核细胞（大肠杆菌的克隆载体）和真核细胞的克隆载体。第一节质粒载体一、质粒（plasmid）是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。（1）分子量小：1—200kb（2）编码基因少：2—3个中等大小的蛋白质。（3）环形状：双链环状DNA。（酵母的“杀伤质粒”是RNA）。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。1.质粒的一般生物学特性（4）质粒的空间构型：①共价闭合环状DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）CovalentclosecircularDNA③线形DN

3、A（linear，lDNA）一条链上有一至数个缺口。②开环DNA（opencircular，ocDNA）（5）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL二、质粒的类型在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒（conjugativeplasmid)非接合型质粒（non-conjugativeplasmid)能自我转移不能自我转移除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒、或F因子）：又叫自我转移型质粒。1.接合型质粒：不符合基因工程的安全要求。大肠杆菌接合

4、（conjunction）2.非接合型质粒：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。（1）R质粒（抗性质粒）：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。符合基因工程的安全要求。带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。（2）Col质粒：大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。三、质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性)在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄

5、主细胞系中稳定共存，这一现象称为质粒的不相容性,又称质粒的不亲和性。三、质粒载体的构建1.质粒载体的发展概况第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二阶段：增大载体容量(降低载体长度)，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,如pUC系列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。三、质粒载体的构建2.质粒的命名用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编

6、号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322为编号。分子量大，拷贝数低三、质粒载体的构建3.天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长9.1kb。但只有一个EcoRI切点充当克隆位点，Tetr作为筛选标志。（1）具有复制起点（ORI）4.质粒载体必须具备的基本条件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性内切酶的单一位点：是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。当带有抗菌素抗性基因的载体

7、进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。抗菌素选择原理活死抗性基因抗菌素四、经典的大肠杆菌质粒载体1.pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。（1）类型天然质粒，属低拷贝型。（2）长度9.09kb。（3）选择标记四环素抗性Tetr有Hind、EcoR、BamH、Sal、Xho、Pvu、Sma7种核酸内切限制酶酶切位点