改良型TAT-VP3融合蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备.pdf

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1、·9O·现代泌尿生殖肿瘤杂志2012年4月第4卷第2期JContempUrolReprodOncol，April2012，Vol4，No．2·实验研究·改良型TAT—VP3融合蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备张之甲李俊詹辉王剑松颜汝平丁明霞刘靖宇王伟李宁doi：10．3870／j．jssn．1674—4624．2012．02．008【摘要】目的表达、纯化改良型TAT-VP3融合蛋白，并制备其多克隆抗体。方法利用原核表达载体PGEX-6P一1／改良型TAT—VP3在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达，经GST标签纯化树脂纯化蛋白，并用PreScissionPr

2、otease酶切除标签，以纯化的蛋白免疫新西兰大白兔，获得改良型TAT-VP3融合蛋白的多克隆抗体。用ELISA进行效价检测，Westernblotting鉴定其特异性。结果诱导表达并纯化了改良型TAT-VP3融合蛋白，纯度大于9O，蛋白浓度为1．2mg／ml。制备了该蛋白的多克隆抗体，ELISA表明多克隆抗体效价为1：32000，Westernblotting证明多克隆抗体的特异性良好。结论成功纯化出改良型TAT—VP3融合蛋白，并制备出高效价、高特异性的多克隆抗体，为进一步研究该蛋白的体内外抗肿瘤活性及作用机制奠定了基础。【关键词】融合蛋白；蛋白纯化；多克隆抗体

3、Expression，purificationofimprovedTAT-VP3fusionproteinandpreparationofitspolyclonalantibodyZHANGZhi-jia，LIJun，ZHANHui，W-ANGJian—song，YANRu—ping，DINGMing—xia，L儿，Jing—yu，WANGW，LINing．DepartmentofUrology，the2ndAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650101，ChinaCorrespondingaut

4、hor：WANGJian—song，E-mail：jiansongwang@yahoo．com[Abstract]0bjectiveToexpressandpurifyimprovedTAT—VP3fusionproteinandtoprepareitspolyclonalantibody．MethodsPGEX-6P一1／improvedTAT‘VP3wasexpressedinE．coliRosetta(DE3)．TheexpressedproteinwaspurifiedbyGSTResin．ThelabelofproteinwascutbyPreScissi

5、onProtease．ThepurifiedproteinwasusedtoimmunizeNewZealandrabbitsforpreparingpolyclonalantibody．ThetiterofthepolyclonalantibodywasdetectedbyELISA．ThespecificitywastestedbyWesternblotting．ResultsThepurityofimprovedTAT—VP3fusionproteinwashigherthan90，anditsconcentrationreached1．2mg／m1．Itsp

6、olyclonalantibodyshowedatiterof1：32000byELISA．SpecificitywasconfirmedwellbyWesternblotting．ConclusionsTheimprovedTAT—VP3isexpressedandpurifiedsuccessfully．Thepolyclonalantibodyisalsoofhightiterandspecificity．Ourstudyprovidedthefoundationforfurtherresearchofitsantitumoractivityandmechan

7、isminvitroandinvivo．[Keywords]Fusionprotein；Proteinpurify；Polyclonalantibody随着生命科学的不断进步，肿瘤的治疗已不再VP3能特异性诱导肿瘤细胞和转化细胞发生凋亡，局限于常规的手术和放、化疗等方法，一些生物治疗而对人体正常的二倍体细胞无诱导凋亡的作用_1]，技术越来越成熟，尤其是肿瘤的基因治疗，已有不少且这种选择性凋亡既不依赖于p53的介导，也不被高效抗肿瘤药物成功应用于临床。bcl一2过表达所抑制[2]。这样的特点使VP3很快成VP3是由鸡贫血病毒(CAV)编码产生的一种为了研究的热点，