抗人FXYD3单克隆抗体的制备与初步鉴定.pdf

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1、第11卷第25期2011年9月科学技术与工程Vo1．11No．25Sep．20111671—1815(2011)25—6019—05ScienceTechnologyandEngineering⑥2011Sci．Tech．Engrg．抗人FXYD3单克隆抗体的制备与初步鉴定马焕先高丽杰张爱群周宁新(解放军总医院肝胆外科。，北京100853；解放军总医院野战外科研究所，北京100853；第二炮兵总医院肝胆胃肠病研究所，北京100088)摘要制备抗人FXYD3单克隆抗体(McAb)并鉴定其生物学特性，以固相合

2、成法获得的FXYD3合成多肽与载体蛋白KLH偶联后免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗人FXYD3McAb。用ELISA、WesternBlot、免疫组化技术对抗人FXYD3McAb的亚型、效价、亲和力及特异性进行鉴定。筛选出两段较好的优势抗原表位，分别为NDLEDKNSPFY和KFGQKSGHH—PGETPPLITPGSA。获得四株可稳定分泌抗人FXYD3McAb的杂交瘤细胞株02A12CA、02F1E8、02E6B10与03A10E11，亚型鉴定重链均为IgG1，轻链为kappa链。间接ELIS

3、A法测定效价均在为1：10以上。其中02F1E8效价为1：10以上，亲和常数为3．11x10L／mol。免疫组化分析显示了FXYD3均匀分布于肝癌细胞与人胰腺癌Bxpe-3细胞系细胞的胞膜上。结果成功制备了四株抗人FXYD3McAb，其中02F1E8纯度好、效价高及特异性强。为进一步研究FXYD3在肿瘤组织及细胞系中的表达及临床意义奠定了基础。关键词离子通道调节子FXYD3杂交瘤细胞单克隆抗体中图法分类号R392．4；文献标志码B近年来小分子单跨膜蛋白在细胞水平的重要关系奠定基础。调节作用逐渐得以认识及进

4、一步深入的研究。其中FXYD蛋白是新近研究的焦点。FXYD家族具有1材料与方法由35个氨基酸组成的信号序列，包含位于跨膜区周围的7个恒定氨基酸以及信号序列始端恒定的基序1．1材料PFXYD(脯氨酸一苯丙氨酸一x一酪氨酸-天冬氨酸)。(6～8)周雌性BALB／c小鼠由解放军总医院实Sweadner与Rael⋯于2000年根据FXYD基序及其验动物中心提供，SP2／0骨髓瘤细胞由北京赛驰生结构特点将FXYD家族进行了界定。FXYD3(MAT．物有限公司提供，人胰腺癌细胞系BxPc一3购自上8，乳腺肿瘤标志物)

5、以其独特的双跨膜结构区域海中科院细胞所，乳腺癌组织来自解放军总医院普区别于家族其他成员。BriggsW．Morrison等学者通外科手术标本，弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂研究发现FXYD3可能是c．neu或v—Haras癌基因转(GIBCOBRL)，100×HAT及100×HT培养基化所必需的组成部分，Grzmil等认为FXYD3蛋白与(GIBCOBRL)，RPMI-1640培养基(GIBC0一细胞增殖和抗增殖过程有关J。因此利用FXYD3BRL)，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，酶单克隆抗体研究其

6、在消化系统肿瘤组织的表达情标二抗(北京中杉金桥有限公司)，匙孔虫戚血蓝蛋况及临床意义显得尤为重要。本课题组采用杂交白(KLH)交联试剂盒(Sigma)，抗体亚类鉴定试剂瘤技术制备抗人FXYD3单克隆抗体，并对其生物学(Pharmacia)，96孔酶标板，24孔细胞培养板(Bio—特性进行初步鉴定，为进一步研究FXYD3与肿瘤的Rad)，酶标仪(ThermoelectroncorporationUSA)．ProteinGSepharose亲和层析柱(Pharmacia)。2011年5月20日收到，5月31日

7、修改1．2方法第一作者简介：马焕先(1980～)，女，汉族，山西河曲人，博士。E—1．2．1抗原表位的分析与多肽合成mail：shania80@sohu．com。根据HomosapiensFXYD3(BC005238．1GI：通讯作者简介：周宁新。E．mail：zhounx301@163．com。＼忡莨25期∞∞∞∞∞如马加焕m先0，等：抗人FXYD3单克隆抗体的制备与初步鉴定6021∞∞舳∞如∞如加0和，由此可见所获得的抗体分泌细胞为小鼠细胞和基峰SP2／0细胞的融合体。2．4单克隆抗体的制备及纯化分子

8、离子峰采用腹水制备法生产单克隆抗体，腹水形成的、阳性率为97％，腹水的产量平均为5．48mL。腹水1r抗体经蛋白G—Sepharose柱亲合层析法分离纯化，根据亲和层析洗脱各管的OD舳绘制曲线(图3)。纯‘．．“▲^j-．．化后的蛋白含量为0．75mg／mL，纯度为87．3％。500l00015002000250030003500400010％SDS—PAGE电泳结果显示纯化的抗人FXYD3质荷比(a)McAb用DTI"处理后