鸡传染性支气管炎病毒Real-time RT-PCR检测方法的建立及应用.pdf

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1、中国摩亏c亟提2013，29(8)：45—49ChineseAgriculturalScienceBulletin鸡传染性支气管炎病毒Real—timeRT—PCR检测方法的建立及应用王鹏，高峰，王园，杨莹，路红，周双海，刘风华(北京农学院动物科学技术学院，北京)摘要：为定量检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)载量，建立IBV的Real—timeRT-PCR方法。用RT-PCR方法扩增出IBV的Ⅳ基因片段，并克隆到pEASY-T3载体中，构建成含有Ⅳ基因片段的重组质粒。应用该重组质粒进行SYBRGreenIReal—timePCR，建立了定量检测IBV核酸的标准曲

2、线与直线回归方程，该方法显示：特异性强，检测下限至少达到5．58x10拷贝／，其重复性试验的变异系数小于3．2％；用建立的方法对实验接种IBVM41株的雏鸡组织中的病毒核酸进行了定量检测，检测结果显示：攻毒后肾脏中IBV含量高于支气管和肺脏，支气管和肺脏中病毒含量在攻毒后第3天高于攻毒后第7、1O天，并证实临床表现与病毒载量之间存在密切关系。研究结果表明，建立的Real—timeR11．PcR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好，可用于IBv的定量检测。关键词：鸡传染性支气管炎病毒；Rea1．timeRT-PCR；定量检测中图分类号：$855．3文献标志码：A

3、论文编号：2012．3874DevelopmentandApplicationofReal-timeRT—PCRAssayforChickenInfectiousBronchitisVirusWangPeng，GaoFeng，WangYuan，YangYing，LuHong，ZhouShuanghai，LiuFenghua(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,BeijingUniversityofAgriculture，Beijing102206)Abstract：Theobjectiveofthisstudy

4、wastodevelopaReal—timeRT—PCRassayofchickenInfectiousBronchitisVirus(IBV)andthereforetodetecttheloadIBVquantitatively．AfragmentofNgeneinIBVwasamplifiedwithRT—PCRmethod．andwasclonedintothevectorpEASY—T3．Then．therecombinantplasmidcontainingtheNgenefragmentwasconstructed．Thestandardcurve

5、andcorrespondinglinearregressionequationofIBVnucleicacidlevelweredevelopedbyReal—timePCRbasedonSYBRGreen1withtherecombinantplasmid．Thismethodshowedahighspecificityandhadadetectionlimitof5．58x1o2eopies／IxL．anditscoefficientofvariationswaslessthan3．2％inthereproducibleassays．Thevirusnuc

6、leicacidintissuesamplesfromchickensinoculatedexperimentallywithIBVM41strainwasquantitativelydeterminedwiththeestablishedReal—timeRT—PCR．ThedetectionresultsshowedthattheloadofIBVinthekidneywasmorethanthatinbronchusandlungafterinoculation．andthevirusloadinthebronchusandlungon3dayspost—

7、inoculationfDPI)werehigherthanthoseon7DPIand10DPI．Moreover，thecorelationbetweentheclinicalmanifestationsandviralloadwasconfirmed．TheresultsindicatedthatthisReal—timeRT—PCRassaywasofhighspecificity，sensitivityandreproducibility，andcouldbeusedforthequantitativedetectionofIBV．Keywords：I

8、BV：Real—time