葡聚糖多克隆抗体竞争抑制ELISA检测方法的建立.pdf

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1、2009年l2广西轻工业第12期(总第133期)GUANGXIJOURNAl_OFLIGHTINDUSTRY食品与生物葡聚糖多克隆抗体竞争抑制ELISA检测方法的建立曾练强，王生育，李雨虹。，颜江华。，黄霄红，梁达奉1,3(1．广州甘蔗糖业研究所／广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州5l03l6；2．厦门大学医学院，福建厦门361005；3．广东工业大学轻工化工学院，广东广州5l0009)【摘要】采用广州甘蔗糖业研究所和厦门大学共同研制的抗葡聚糖多克隆抗体和DEX-OVA交联的免疫原，确定了最佳的抗原包被浓度为5ug／ml，最佳的多抗工作浓度为1：8000。

2、建立了竞争抑制ELISA定量检测葡聚糖的方法，并尝试了对原糖样本的检测。【关键词】葡聚糖；多克隆抗体；竞争抑制ELISA；定量检测；原糖【中图分类号】TS201【文献标识码】A【文章编号】1003—2673(2009)12—11—02前言应用葡聚糖多克隆抗体，建立葡聚糖抑制竞争ELISA法日以Dextran40一OVA交联物最佳包被浓度5g／ml包被96从原理上说，葡聚糖的检测方法大体上可分为两大类：一。类是基于葡聚糖发生化学变化的原理，即通过化学反应使葡聚孔板，设阳性、阴对照。抗体为确立的最佳稀释度(1：8000)，糖变成可直接检测的其它物质进行测定，如Rober

3、t铜法是葡标准竞争抑制物为梯度稀释的葡聚糖，进行板内竞争反应lh，聚糖用硫酸水解后变成葡萄糖，再用酚显色，通过测定葡萄糖其他步骤同上述间接ELISA方法。根据酶标仪渎取OD490的量来推算葡聚糖的含量Ⅲ；另一类是基于葡聚糖物理性质的的数值，计算抑制率，以抑制率(A标／A0×％)为纵坐标，以抑原理，如Haze法、SPRI法，是利用葡聚糖会在酒精中沉淀，产制浓度为横坐标，绘制葡聚糖标准曲线。生浊度，通过比较浊度的大小而判定葡聚糖的含量。但目前常1．2．3葡聚糖竞争抑制ELISA方法16)检测原糖样本用的葡聚糖定量检测方法都存在预处理困难、操作复杂、杂质以Dextran4

4、0一OVA交联物最佳包被浓度5g／ml包被干扰严重影响结果等缺陷12．1。免疫学检测法是一个很有前景的96孔板，设阳性、阴性对照。抗体为确立的最佳稀释度(1：方向，具有快速、准确、样本预处理简单等优点，适合于制糖工8000)，为消除蔗糖在过程中的影响，用与原糖浓度相同的蔗糖艺任一工序中葡聚糖含量的测定。溶液和梯度稀释的葡聚糖混合液作为标准竞争抑制物，进行板本文采用广州甘蔗糖业研究所和厦门大学医学院共同研内竞争反应1h，其他步骤同上述问接ELISA方法。根据酶标仪制的葡聚糖多克隆抗体，初步建立了葡聚糖的竞争抑制读取OD490的数值，计算抑制率，作出标准曲线。ELISA

5、检测方法。同时以Dex／ran40一OVA交联物最佳包被浓度5g／ml包被96孑L板，设阳性、阴性对照。抗体为确立的最佳稀释度(1：1材料与方法8000)，用原糖样本作为竞争抑制物，进行板内竞争反应1h，其1．1主要仪器及试验材料他步骤同上述间接ELISA方法。根据酶标仪读取OD490的数BIO—RAD680酶标仪；Dextran40、2000为Pharmacia公值，计算抑制率，和标准曲线中的抑制率比较，可得到原糖中葡司产品；抗葡聚糖阳性抗体为StemCell产品，其它试剂为国产聚糖的含量值。试剂；葡聚糖多克隆抗体为广州甘蔗糖业研究所和厦门大学医学院共同研制。2结

6、果与分析1-2葡聚糖竞争抑制ELISA方法的建立2．1最佳包被浓度与抗体稀释度的确立ll7l1方阵法确定抗原包被浓度和抗体的工作浓度ELISA实验结果见表1。根据表中的试验数据，在其它因将DextranT40一OVA交联物按2．5、5、10、20g／mL横向素相同的情况下，在包被浓度5g／ml，稀释度为1：8000时，包被酶标板，每孔1OOL(纯化的抗体经适怖释后与梯度稀OD490值为1．365。释的标准葡聚糖溶液各50L)，37~C，过夜。用封闭液(10％正根据OD值应在1．0—1．5之间，且包被抗原及单抗用少常人血清)封闭2h；每孔加入不同稀释度的多抗1O0LL

7、l(1：的原则，我们选择包被浓度为5斗g／ml，抗体的稀释度为1：1000⋯⋯1：128000)，同时设立阳性、阴性对照，37％放置lh；8000。用PBST洗涤液洗3次后，加羊抗兔酶标二抗，37℃放置1h；再2_2葡聚糖竞争ELISA标准曲线的建立用PBST洗3次，加入OPD底物溶液，37℃避光放置15rain；加标准葡聚糖抑制浓度按1024g／ml倍比稀释，用已经建终止液(2MH!SO溶液)终止反应。酶标仪渎取OD490结果，立的ELISA方法做间接竞争抑制ELISA检测，实验结果表根据OD490值及具体情况确定包被浓度和抗体的工作浓度。明，当葡聚糖浓度大于