免疫荧光实验步骤.doc

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1、免疫荧光实验步骤'V  b3e)h:r;_1.直接免疫荧光法测抗原*_4Q9A+c3Q:w  s:N（1）基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。（2）试剂与仪器5Y2?3[$T(a*gl    磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4    荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释l8R7a;q

2、7p5o1`    缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+pH9.2l0.2M碳酸盐缓冲液1份配制    搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS1500ml）l    有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）l3{7b%d#x6N&A+A7g.o/w:O    荧光显微镜l    玻片架l"G8o2~1W+M3s)_  B    滤纸l%J!b+F1F/

3、'v  vl    37℃温箱等。（3）实验步骤①滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。②滴加适当稀释的荧光标记的

4、抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。③取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5min，不时振荡。)s5@&L%'A$M([)@　　④取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。⑤立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。待

5、检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。6q&{%p/r  ['b*V（4）注意事项%C#U2v$M9~$W&W　　1)对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10min到数小时，一般30min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长

6、染色时间。低温染色过夜较37℃30min效果好的多。!e*`/P;L"[4l5U4_　　3)为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。①标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。③阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。.Q'P!U+y's:Y4u　　4)一般标本在高压汞灯下照射超

7、过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。/D,i/x"o8Z)G0N'@5P,{:T7m  n"d2.间接免疫荧光法测抗体/~0N  _"H&H$U(~:O%D:u（1）基本原理染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定

8、未知抗体。1C)J3F  ?4H  H;V)P（2）试剂与仪器l    磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4!i:Y:t#I+_7X2B    缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+pH9.20.2M碳酸盐缓冲液1份配制。l%A(p)~:p(~1{,q/k;T    l荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释。$[#m(o4{8N)g'}"g0]    搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS1500ml）l    有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）l-F"t(s1a

9、6P1t    荧光显微镜l0F0X;h$k6i$N5{:Y8j:S*s    玻片架l!q6c3}'e9N4p,j%~8o    滤纸l-'4u*B*v    37℃温箱等。l（3）实验步骤1)滴加0.01mol/