Western-blot(蛋白印迹法)详细步骤.doc

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1、Westernblot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h以上。2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。3.每

2、种样品都最好留有副管，备用。二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（

3、BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。②按下表在酶标仪中加入试剂，绘制标准曲线。孔号0123456蛋白标准液（μl）01246810去离子水（μl）10986420蛋白含量（μg）01246810③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。④每个标准品孔加入200μlBCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为

4、纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。注意：1.标准曲线一般做两组，取最好的标准曲线计算。2.蛋白浓度=（蛋白含量/总体积）×稀释倍数[μg/μl]3.保证样品液中的蛋白含量相同（500μg/100μl）,则取10μl样品液中含有50μg蛋白。4.样品液稀释液要再沸水浴中煮10min（可用微波炉加热），放凉至室温后于-20℃保存。一、SDS-PAGE蛋白质电泳(一)、配胶准备：凝胶液各成分、电泳板、制胶架、梳子步骤:①选择适合电泳板（0.75mm:1.0mm:1.5mm），用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗，将玻璃板夹入玻璃板夹，注意底部对齐，夹好后卡到制胶架上。②首

5、先配制分离胶（一般用12%的SDS-PAGE分离胶），按分离胶配方配制，配胶时最后加APS和TEMED，迅速混匀，注意减少气泡的产生。③将配好的分离胶迅速加入玻璃板之间至梳子下约1cm处（绿色线处），不要有气泡。灌好胶后用蒸馏水覆盖胶层，加满蒸馏水至玻璃板顶端，以利于丙烯酰胺的聚合。室温静置约30min至胶层与水层检出现明显界限。若室温过低可将其置于37℃烘箱中。④配制浓缩胶（5%的Arcymalide浓缩胶），混匀，注意减少气泡产生。⑤带分离胶聚合后，倒掉上层水，将混匀的浓缩胶沿玻璃板壁小心加在分离胶上至较短玻璃板顶端，插好梳子，不能有气泡，室温静置20~30min至凝胶聚合。注意：1

6、.夹好玻璃玻璃板后用水检查其是否漏水。2.12%分离胶配方：不同体积（ml）凝胶液各成分所需体积（ml）溶液成分51015202530H2O1.63.34.96.68.29.930%Arcylamide2.04.06.08.010.012.01.0MTris-HCL(PH8.8)1.32.53.85.06.37.510%SDS0.050.10.150.200.250.3010%APS0.050.10.150.200.250.30TEMED0.0020.0040.0060.0080.0100.0123.SDS-PAGE浓缩胶配方（5%Arcylamide）不同体积（ml）凝胶液各成分所需体

7、积（ml）溶液成分234568H2O0.681.42.73.44.15.530%Arcylamide0.170.330.670.831.01.31.0MTris-HCL(PH8.8)0.130.250.50.630.751.010%SDS0.010.020.040.050.060.0810%APS0.010.020.040.050.060.08TEMED0.0010.0020.0040.0050.0060.0084.配胶时加入的AP