慢病毒介导的shRNA对A549细胞Pin1表达的干扰作用.pdf

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1、细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2014，30(3245·论著·文章编号：1007—8738(2014)03—0245—05慢病毒介导的shRNA对A549细胞Pin1表达的干扰作用赵帅，董文斌，张婵，李清平，康兰，雷小平，郭琳，翟雪松(泸州医学院附属医院新生儿科，四JII泸州646000)[摘要]目的构建PinshRNA慢病毒载体，建立稳定抑制肽基脯氨酰顺反异构酶1(Pin1)表达的A549细胞系。方法根据查阅文献获得PinlshRNA干扰靶点序列并插入pLenR-GPH载体，构建pLenR．GPH．PinlshRNA慢病毒载体，随后转入人胚肾HEK29

2、3T细胞中，收集其上清进行病毒滴度测定，再行慢病毒的包装，将获得的慢病毒毒液感染A549细胞。通过实时定量PCR(qRT-PCR)及Westernblot法检测Pin1在不同组的表达抑制情况。结果经限制性内切酶鉴定及测序分析，成功构建了pLenR-GPH-PinlshRNA慢病毒载体质粒，包装并得到高滴度的病毒颗粒。通过qRT．PCR和Westernblot法检测显示，与对照组相比，pLenR-GPH-PinlshRNA慢病毒载体感染的A549细胞中Pin1的表达在mRNA和蛋白水平均有所下降。结论慢病毒介导的shRNA能够有效下调A549细胞中Pin1的表达。[关键词]肽基脯氨酰顺反

3、异构酶1(Pin1)；慢病毒载体；A549细胞；基因表达[中图分类号]R392—33，Q813．11，R734．2[文献标志码]ATheinterferenceefectofientiviralmediatedshRNAontheexpressionofPin1inA549cellsZHAOShuai，DONGWenbin，ZHANGChan，LIQingping，KANGLan，LEIXiaoping，GUOLin，ZHAIXuesongDepartmentofNewbornMedicine，AfiliatedHospital，LuzhouMedicalCollege，Luzhou6

4、46000，ChinalAbstractlobjectiveToconstructaPinlshRNAIentiviralvectorandtransfectstablyA549cells．MethodsThepeptidyl-proplylcis-transisomerase1(Pin1)genesequencesfr0mGenBankwereclonedintothepLenR-GPH-shRNAlentiviralvector．ThepLenR-GPH-shRNAandlentivectorpakagingplasmidmixwerecotransfectedintohumane

5、mbryonickidneycellsHEK293TtopackagelentMralparticles．Thevirussupernatantwasharvested，andthenthevirustiterwasdeterminedbyserialdilutionassay．TheA549cellsweretransducedwiththeconstructedlentiviralvectors．Real-timequantitativePCR(qRT-PCR)andWesternblottingwereusedtoevaluatethePinlexpressionindifere

6、ntgroups．ResultsRestrictionenzymeanalysisandsequencingdemonstratedthattherecombinantplasmidnamedpLenR-GPH-PinlshRNAwassuccessfullypreparedandhadahightiter．qRT-PCRandWesternblottingrevealedthatthesignificantdown-regulationofPin1expressioninA549cells．ConclusionThelentiviralmediatedshRNAcanefective

7、lydown·regulatetheexpressionofPin1inA549cells．[Keywords]Pin1；lentiviralvector；A549cel；geneexpression新生儿特别是早产儿的救治过程，常需要吸人调节细胞氧化应激反应的关键蛋白。高氧环境下其高体积分数氧(高氧)，部分患儿在早期易导致急性通过活化蛋白激酶ci3(proteinkinasecp，PKcp)，使肺损伤，继而可能发展至肺纤维化及支气管肺发育胞质