禽流感血凝素HA超表达载体的构建及高表达百脉根的获得.pdf

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1、138—145草业学报第23卷第4期2014年8月ACTAPRATACULTURAES1NICAVo1．23，NO．4禽流感血凝素HA超表达载体的构建及高表达百脉根的获得张伟伟，袁蓓，张占路。，赵杨敏。，徐秉良，吴燕民(1．甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州730070；2．中国农业科学院生物技术研究所，北京100081；3．深圳市农科集团有限公司，广东深圳518040)摘要：为提高外源抗原蛋白的表达水平，根据已得到的HAITB融合基因，通过添加双增强子CaMV35S启动子、增强子Q序列、内质网滞留信号KDEL序列及加长poly(A)序列等表达调控元件，构建HA—

2、LTB高效融合植物表达载体。利用农杆菌介导方法转化百脉根，获得转基因阳性植株21株，经PCR和RTPCR检测表明HA—ITB融合基因已整合到百脉根基因组中。利用ELISA检测转基因植株，结果表明ITB免疫佐剂与HA抗原蛋白均具有免疫原性，LTB最高表达量达到0．086ptg／mg(蛋白粗提液)，HA最高表达量达到0．25／xg／mg(蛋白粗提液)。通过植物表达载体的设计和构建，使禽流感血凝素在百脉根中的表达量得到了显著提高，为禽流感可饲疫苗的研制奠定了基础。关键词：百脉根；载体构建；HA抗原蛋白；ITB免疫佐剂；高表达中图分类号：$851．3文献标识码：A文章

3、编号：1004—5759(2014)04—013808D0I：10．1l686／cyxb20140417自2003年到2013年，高致病性禽流感H5N1共引起人患病630例，致死375人，大规模捕杀家禽及候鸟数量更是数以亿计，给世界各地造成严重的经济损失和巨大的生命安全威胁。早在1992年，Mason等_1提出了“植物可食疫苗”的概念，成功利用烟草(Nicotianatabacum)表达了乙肝表面抗原(HBsAg)基因。近十年已有大量的抗原被植物表达，包括抵御HIV的2G12抗体]、乙肝表面抗原]、霍乱毒素B亚基]、大肠杆菌热敏毒素B亚基Ⅲ7]、狂犬病毒G蛋白

4、等，但是目前禽流感植物疫苗的报道还是较少且抗原蛋白表达量低限制了植物疫苗进一步的发展。大量研究表明，影响重组药用蛋白在植物中表达量的因素包括很多方面。一是转录水平，启动子的选择是提高外源基因表达水平的关键。常用的启动子分为组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子和人工合成启动子。前3种启动子都可以实现外源基因的表达与调控，但人工合成启动子能够进一步提高外源基因的表达水平。如重复CaMV35启动子的增强子序列，构建双35S启动子，可显著提高外源基因的表达水平n¨。终止子通过终止转录和对mRNA3端的加工调节转录水平，进而影响外源基因在植物中的表达水平。Nag

5、aya等[㈦分别比较了不同终止子，发现热击蛋白18．2终止子能有效提高外源基因表达水平。二是翻译水平，研究表明通过增强mRNA的稳定性[1J，按照植物偏爱密码子进行密码子优化可有效提高重组蛋白的表达水平口。三是翻译后水平，重组蛋白合成后，利用不同定位信号可以定位于不同的亚细胞结构中，亚细胞结构的生理生化环境、存储空间等多种因素都影响着蛋白的积累水平。为外源蛋白选择合适的分拣部位，有助于其高浓度富集。例如在重组蛋白C一添加内质网滞留信号序列一KDEI，可以增加外源蛋白在内质网中的积累水平。。。郑琳琳等口阳证明可通过构建超表达载体有效提高外源基因的表达水平。本研究

6、选择豆科全价饲料牧草百脉根(Lotuscorniculatus)l1作为受体植物，在已建立的，以磷酸甘露糖异构酶基凶(PMI)为筛选标记的，安全高效的百脉根遗传转化体系的基础上，利用已获得的禽流感血凝素(HA)和收稿tt期：2014—01—15；改回日期：20140226基金项日：国家重点基础研究发展计‘划“973”项日(2014CB138701)和国家自然科学基金资助项目(31372361)资助。作者简介：张伟伟(1988一)，女，山东潍坊人，在读硕士。Email：zhangweiwei1002132@163．corn*通讯作者。E—mail：Wuym65@

7、sina．com，xubl@gsau．edu．cn第23卷第4期草业学报2014年大肠杆菌不耐热毒素B亚基(LTB)融合基因，通过添加强启动子，增强子Q序列、KDEL序列及加长poly(A)序列等多种调控元件，构建HA—LTB高效融合植物表达载体，以期提高HA抗原蛋白表达量，建立外源融合抗原蛋白高水平表达平台，为禽流感可饲疫苗的研制奠定基础。1材料与方法!．1材料1．1．1植物材料百脉根：栽培品种里奥(L．corniculatusCV．Leo)由中国农业科学院生物技术研究所作物与分子实验室提供。1．1．2菌种及载体大肠杆菌DH5a、根癌农杆菌LBA4404由本

8、实验室保存，pCAMBIA2301、p