基因表达差异分析方法进展

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1、高等真核生物的基因组一般具有80000～100000个基因，而每一个细胞大约只表达其中的15%［1］。基因在不同细胞间及不同生长阶段的选择性表达决定了生命活动的多样性，如发育与分化、衰老与死亡、内环境稳定、细胞周期调控等。比较细胞间基因表达的差异为我们揭示生命活动的规律提供了依据。　　由于真核细胞mRNA3′端一般含有Poly（A）尾，因此现有的方法基本上都是利用共同引物将不同的mRNA反转录成cDNA，以cDNA为对象研究基因表达的差异。1992年Liang等［2］建立了一种差异显示反转录PC

2、R法（differentialdisplayreversetranscriptionPCR，DDRT-PCR），为检测成批基因表达的差异开辟了新天地。迄今为止已出现了大量应用该技术的研究报道［3，4］。然而，尽管应用DDRT-PCR方法已经取得了不少成果，而且该方法还在不断改进之中，但它仍然存在几个难以解决的问题：(1)重复率低，至少有20%的差异条带不能被准确重复［5］；(2)假阳性率可以高达90%［6］；(3)获得的差异表达序列极少包含编码信息。近年来，针对DDRT-PCR方法的不足，又有几

3、种新的检测差异表达基因的方法出现，现仅就这方面的进展做一简要介绍。　　1.基因表达指纹（geneexpressionfingerprinting，GEF）：GEF技术使用生物素标记的引物Bio-T13合成cDNA第一链，用dGTP对其进行末端加尾，再以富含C的引物引发合成cDNA第二链。用限制性内切酶消化双链cDNA，以交联有抗生物素蛋白的微球捕获cDNA3′端，以T4DNA连接酶连接同前述内切酶相对应的适配子，并以Bio-T13及适配子中的序列作为新的引物进行特异的PCR扩增，得到大量的特异c

4、DNA片段。适配子末端被32P-dATP标记后，固定于微球上的cDNA片段经过一系列酶切，产生的酶切片段从微球表面释放出来，其中那些含有标记末端的片段经凝胶电泳后构成mRNA指纹图谱。通过分析不同细胞间的指纹图谱就能得到差异表达的序列［7］。GEF技术所需的工作量较DDRT-PCR明显减少，由于用酶切反应替代了条件不严格的PCR反应，其重复性也较好，假阳性率低，并且所获得的片段中包含有一定的编码信息。GEF技术最大的缺点在于电泳技术的局限。由于它的指纹图谱要显示在同一块电泳胶上，经过几轮酶切之后

5、常会得到1000～2000条电泳带，而现有的PAGE电泳很少能分辨超过400条带，故只有15%～30%的mRNA能够被辨认出来，因此得到的只能是高表达基因。如果希望寻找部分新基因，这是一种比较简单有效的方法；如果希望得到有关某种细胞的基因表达谱，可能比较困难；采用双向电泳技术可能会有所帮助［8］。　　2．基因表达系统分析（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）：SAGE法的建立基于两条理论。首先，一段来自某个转录子确定位置的核苷酸，其长度只要有9～10个bp，就

6、能够特异地确认该转录子。第二，对短片段标签的链接有利于在同一克隆中对多个标签测序。SAGE也是用生物素标记的Bio-Oligo(dT)为引物合成双链cDNA，然后以限制酶（锚定酶）进行酶切，捕获cDNA3′端。在此处产物被分为两部分，分别与包含有IIS型内切酶（标签酶）位点的A、B连接子相接。IIS型内切酶的特点是作用位点处于识别位点之外。这样经过酶切，就有可能得到只有9～10bp的标签序列。每两个标签的钝端结合后成为PCR的模板，以基于A、B连接子的引物进行PCR反应的结果是得到了大量每条包含

7、两个不同来源标签的序列，接下来再用锚定酶酶切、连接，就能将多个不同的标签链接在一起（大约为每条包含数十个不同来源的标签），克隆至质粒载体中后集中测序［9，10］。SAGE的最终结果是通过计算机统计得到的，根据某个标签出现频率的高低来判断并计算其所属基因表达的丰度。对于在数据库中找不到对应序列的标签，还可以利用13bp的寡核苷酸探针（9bp加上锚定酶识别位点的4bp）对cDNA文库进行筛选，以寻找新基因。SAGE可以检测不同细胞间已知基因表达的具体差异，精确到每个细胞中大约有多少拷贝，可以建立较全

8、面的基因表达谱，系统地分析基因表达的差异。它的缺点在于工作量非常大，有大量的测序及计算机分析任务；而且，对于寻找新基因而言，仅用长度为13bp的寡核苷酸探针筛选cDNA文库是很不严格的，根据我们的经验，往往是假阳性结果居多。　　3.cDNA3′端限制酶切片段显示（displayof3′endrestrictionfragmentsofcDNAs）:cDNA3′端RFD利用带有“踵”结构的锚定Oligo(dT)引物合成cDNA第一链，以Okayama和Berg的置换法合成cDNA第二链，然后将双链