胃轻瘫大鼠胃平滑肌g蛋白表达异常和消痞方干预探究

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1、胃轻瘫大鼠胃平滑肌G蛋白表达异常和消痞方干预探究　　摘要：目的探讨胃平滑肌细胞G蛋白在胃轻瘫发病机制中的作用以及中药消痞方的防治效果。方法健康雄性SD大鼠50只随机分为五组，每组10只，分别为正常对照组、模型组、低剂量治疗组、中剂量治疗组和高剂量治疗组。四氧嘧啶50mg/Kg静脉注射1次，建立大鼠糖尿病模型，大鼠给药量按临床成人的剂量，通过体重系数折算成高、中、低剂量，正常对照组和糖尿病模型组给予相应剂量的生理盐水。营养性半固体米糊法测定胃排空率，放射免疫方法测定胃平滑肌细胞cAMP含量。核酸原位

2、杂交方法和计算机图像分析系统对平滑肌细胞的Gsα、GiαmRNA的表达进行定量分析。结果①胃排空率：模型组及低剂量组较中、高剂量组和正常组明显减（P0.05）。结论消痞方通过调节胃平滑肌的Gsα-mRNA的表达量及cAMP的含量维持在接近正常水平，对于糖尿病胃运动功能具有保护和改善作用。关键词：糖尿病；胃肌轻瘫；胃排空中图分类号：R587.1胃轻瘫是糖尿病的常见合并症，包括上腹部饱胀、恶心、呕吐等症状[1]，8Kassander在1958年首先提出糖尿病胃轻瘫的概念[2]。关于其发病机制没有完全清

3、楚，目前认为可能和以下因素有关：神经病变、高血糖、胃肠激素及ICC细胞异常等[3]，有关胃平滑肌细胞G蛋白表达在其发病机制中的作用，以及中药的影响目前国内外罕有报道。因此，本文试图探讨胃平滑肌细胞G蛋白在其发病机制中的作用以及中药消痞方的防治效果。1资料与方法1.1动物与分组健康清洁级成年雄性SD大鼠50只，体质量250～270g，购自中国军事医学科学院。随机分为5组（每组10只）：正常对照组、模型组、低剂量治疗组、中剂量治疗组和高剂量治疗组。1.2模型制备及标本采集实验大鼠先稳定3d，然后给予禁

4、食12h，尾静脉注射四氧嘧啶50mg/Kg/次，1w后测定血糖浓度≥16.7mmol/L，同时尿糖在（3+）以上确定为糖尿病模型。正常对照组给予等剂量生理盐水注射，余处理同前。实验大鼠分笼饲养12w，每周监测体重、尿糖、24h进食量，饮水量、尿量。处死动物后剖腹迅速沿胃大弯剪开胃腔，在装有Kreb液的烧杯内仔细去除胃内容物。剪取胃窦全层1块1cm×1cm组织平铺于滤纸上置于10%的福尔马林缓冲液中固定、包埋、切片。1.3实验用药消痞方由白术、枳实、党参、炒莱菔子等组成，按比例称取，水煎、过滤，浓缩

5、为38g/mL。大鼠给药量按临床成人的剂量，通过体重系数折算成高、中、低剂量，分别为20g/Kg/d，10g/Kg/d和5g/Kg/d，按1mL/Kg体积灌胃给药，正常对照组和糖尿病模型组给予相应剂量的生理盐水。自造模成功第1d开始至实验结束，1次/d。1.4实验数据测定1.4.1胃排空率测定参考文献方法[4]胃排空率以（1-胃内容物残留率）表示。实验大鼠禁食不禁水12h后，给予营养性半固体米糊灌胃，用量为1mL/100g，灌胃30min后脱颈处死大鼠，剖取全部胃肠，自幽门切迹处取胃，拭干称重，沿

6、胃大弯剪开胃体，洗去胃内容物后拭干称净重，计算胃内容物残留率=[（全胃重-胃净重）/半固体米糊重]×100%。1.4.2胃平滑肌cAMP含量测定取胃窦组织1块，撕去粘膜和浆膜层，按试剂盒说明进行组织匀浆。采用放免法测定，具体步骤按试剂盒说明进行（I125-cAMP放免试剂盒购自上海中医药大学）。1.4.3胃平滑肌细胞Gsα、GiαmRNA的原位杂交同上经石蜡包埋，行5μm的连续切片，置于Poly-L-Lysine处理过的专用载玻片上。石蜡切片常规脱蜡至水化；3%H2O2室温孵育10min去除内源性

7、过氧化物酶；滴加消化液室温孵育15min，以暴露mRNA片断；滴加预杂交液37℃湿盒孵育2h；0.2×SSC洗3次，5min/次；滴加杂交液37℃湿盒孵育48h；梯度SSC洗涤；滴加封闭液，室温孵育；滴加高敏链酶亲和素过氧化物酶复合物（SABC）37℃湿盒孵育40min；PBS冲洗3次，3min/次；DAB避光显色5min，水洗中止反应；Giα指标采用AEC显色；复染，脱水，封片。实验设β-actin为阳性对照，正义探针为探针对照，无探针杂交液为阴性对照。首先在Olympus光学显微镜下初步观察，

8、以胞浆出现棕黄色颗粒（Gsα），亮红色颗粒（Giα）为阳性标志，进一步采用Olympus-BX51计算机图像分析系统采集图像进行半定量分析，每张切片在高倍镜下观察5个视野，测定平滑肌细胞胞浆内阳性物质的光密度，取其平均值进行统计。原位杂交试剂盒购自天津灏洋生物技术有限责任公司。探针序列：Gsα5’AggTTgTTTTTgATgTCCTgCACTTTggT3’Giα5’TggCTCTAATgATggCAATgATggACTggA3’1.5统计学方法采用SPSS10.0软件进行统计学分