淋巴细胞分离.ppt

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1、淋巴细胞的分离技术与培养细胞分离原理与手段基于对细胞物理特性1细胞比重差异（自然沉降法、密度梯度离心法、改变细胞密度法）2细胞的粘附性（贴壁细胞对玻璃、塑料器皿的粘附，B细胞对尼龙棉的粘附）3细胞对渗透压改变的敏感性（红细胞对低渗敏感，低渗处理，能使其裂解）基于细胞表面的特异性标志物1补体细胞毒分离法2免疫磁珠分离法3流式细胞术血液细胞的组成及比重外周血红细胞粒细胞单个核细胞血小板淋巴细胞单核细胞1.0931.030~1.0351.075~1.090(PBMC)1.092单个核细胞的特点单核细胞：贴壁生长，能吞噬羟基铁粉淋巴细胞：悬浮生长1粘附力：B细胞——尼

2、龙棉2细胞表面标志物T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、CD25等NK细胞：CD2、CD8、CD16、CD56等淋巴细胞分离的流程密度梯度离心法粘附去除改变细胞密度法E花环分离法尼龙棉分离法流式细胞术磁珠分离法23单个核细胞的分离—密度梯度离心法原理：外周血各种血细胞的比重不同，利用淋巴细胞分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有Ficoll和Per

3、coll两种。密度梯度离心法Ficoll：1.077±0.001Percoll常用密度20%1.03130%1.04340%1.05650%1.06760%1.07770%1.090细胞比重血小板1.030~1.035单个核细胞1.075~1.090粒细胞1.092红细胞1.093细胞比重分层液比重离心后PBMC红细胞粒细胞Ficoll/60%Percoll稀释外周血稀释的血浆、血小板Ficoll/60%Percoll实验步骤1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2）2.在离心管中加入分层液，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）3.2

4、0℃，1500r/min，离心30min4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中5.加足量稀释液充分洗涤，1800r/min离心10min，弃上清6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清7.适量的培养基重悬细胞，计数8.细胞活性检测1淋巴细胞分离—吸附法和改变细胞密度法单核细胞：贴壁生长，能吞噬羟基铁粉淋巴细胞不具有这些特点粘附去除法原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。方法：1、玻璃器皿吸附法2玻璃纤维柱法优点：简便易行，对细胞损伤极少。缺

5、点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。改变细胞密度法原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。方法一：磁铁吸引法方法二：羟基铁-乳胶分层液法2T、B、NK细胞的分离T细胞能与STBC结合形成E花环——E花环分离T细胞B细胞对尼龙纤维特有的吸附能力——尼龙纤维分离B细胞淋巴细胞表面的标志差异——免疫磁珠分离法与流式细胞术E花环分离法原理：人类T细胞表面上有能与绵羊红细胞相结合的受体（E受体，CD2）,能与经2-氨乙基异硫溴化物（AET）处理的绵羊红细

6、胞结合，形成稳定的、细胞体积和比重较大的E花环。实验步骤1AET-E花环实验：将分离的单个核细胞（20万/ml)与等量的1%AET-SRBC混合，37℃水浴15min,每5min摇匀一次，然后分装，每管2~3ml，低速离心（1000r/min)5min后，4℃冰箱45分钟。2T、B细胞分离：淋巴细胞+SRBC悬液→加入分层液→T细胞形成E花环而沉于管底→悬液中为B细胞。3T细胞分离：取沉淀于管底的E花环，用Hank’s液洗一次后，加双蒸水3ml处理3s，低渗裂解E-花环周围SRBC，立即加3.5%NaCl溶液1ml，使还原为等渗，低速离心沉淀，即的富含T淋巴细

7、胞群。试剂配制AET溶液：称取AET粉剂402mg,溶于10ml去离子水中，用4mol/LNaOH溶液约9～10滴，调至pH9.0，用0.2μm滤膜过滤除菌。用前临时配制。AET-SRBC的制备：1SRBC中加等渗盐溶液（1:4），1800r/min离心5min，连续洗涤5次2取压积的SRBC，加入新鲜配制的pH9.0的AET溶液（1:4），置37℃水浴15min，每隔5min摇匀一次。3加入预冷无菌等渗盐溶液，1800r/min离心5min，连续洗涤5次，4用含小牛血清的RPMI-1640液配成10%AET-SRBC悬液，置4℃保存，不得超过5天。使用时用1

8、0%小牛血清的RPMI-1640培养液