医用基础化学.ppt

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1、第十三章可见分光光度法和紫外分光光度法VisibleSpectrophotometryandUltravioletSpectrophotometry内容提要一、物质的吸收光谱二、分光光度法基本原理1.透光率和吸光度2.Lambert—Beer定律三、可见分光光度法1.分光光度计2.测定方法四、提高测量灵敏度和准确度的方法五、紫外分光光度法简介教学基本要求掌握分光光度法的基本原理，Lambert—Beer定律以及透光率、吸光度、摩尔吸光系数等基本概念及相互关系。熟悉物质对光的选择性吸收，吸收光谱的意义；可见分光光度法的测定方法—标准曲线法和标准对照

2、法。了解光的基本性质，光的加和性；分光光度计的基本构造；比吸光系数比较法、差示分光光度法和双波长法的测定方法；提高测量灵敏度和准确度的方法；紫外分光光度法的一般概念。第一节物质的吸收光谱一、物质对光的选择性吸收光照射某物质，物质能够吸收光，使原有的基态转为激发态，只有当分子的能量(h)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(E)相等时才能被吸收。M(基态)+hM*(激发态)物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。第一节物质的吸收光谱互补色光示意图第一节物质的吸收光谱二、物质的吸收光谱将不同波长

3、的单色光依次通过有色溶液，测量溶液的吸光度A(absorbance)。以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得吸收曲线，或称吸收光谱。吸收光谱中，吸光度最大处的波长为最大吸收波长，用max表示。一般，max是定性鉴别物质的基础。不同浓度的溶液，max不变，浓度与峰值成正比，这是进行定量分析的依据。第一节物质的吸收光谱三(邻二氮菲)合铁(II)离子的吸收光谱图(absorptionspectrum)max=510nm不同浓度的溶液，max不变，浓度与峰值成正比。第二节分光光度法基本原理一、透光率(transmittance)和吸光度(a

4、bsorbance)入射光强度I0，吸收光强度Ia，透过光强度It，反射光强度为IrI0═Ia+It+Ir被测溶液和参比溶液的吸收池同样材料和厚度，反射光强度影响相互抵消，上式简化为I0═Ia+It第二节分光光度法基本原理一、透光率和吸光度透射光的强度It与入射光强度I0之比称为透光率(transmittance)，用T表示透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。A愈大，溶液对光的吸收愈多。第二节分光光度法基本原理二、Lambert—Beer定律Lambert-Beer定律：A=bc溶液厚度b，单位cm；浓度c，单位molL-1；摩尔吸光系数

5、(molarabsorptivity)单位:Lmol-1cm-1若用质量浓度代替cA═ab质量吸光系数(apercentangeabsorptivity)单位:Lg-1cm-1a和可通过下式相互换算═aM当溶液组成表度为10gL-1时，吸光系数可用比吸光系数表示，与和a的关系分别为：第二节分光光度法基本原理第二节分光光度法基本原理透光率T与溶液浓度c(或液层厚度b)之间的关系也可以以指数函数关系来表示：-lgT═bcT═10-bc第二节分光光度法基本原理应用Lambert—Beer定律时，需注意以下几点：Lambert—

6、Beer定律仅适用于单一波长的单色光。入射光的波长范围越宽，则测定结果越容易偏离Lambert—Beer定律。吸收过程中各物质间无相互作用，但各物质的吸光度具有加和性。即A═Aa+Ab+Ac+入射光波长不同时，摩尔吸光系数也不同。摩尔吸光系数越大，溶液对入射光的吸收就越强，测定的灵敏度就越高。分光光度法仅适用于微量组分的测定。(或a)确定是在低浓度下测定吸光度A，通过计算求出。第二节分光光度法基本原理例13-1已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇作溶剂配成浓度为0.150mmolL-1的溶液，在480nm波长处用2.00c

7、m吸收池测得透光率为39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数及质量吸光系数a。第二节分光光度法基本原理解由Lambert—Beer定律可得已知c═0.15010-3molL-1，b═2.00cm，T═0.398代入第二节分光光度法基本原理例测试酶与腺苷酸(AMP)体系的吸光度如下：A(280nm)═0.46，A(260nm)═0.58试计算每一组分的浓度。已知：酶的(280nm)═2.96104Lmol-1cm-1(260nm)═1.52104Lmol-1cm-1AMP的(280nm)═2.4103Lmol-1

8、cm-1(260nm)═1.5104Lmol-1cm-1吸收池厚度为1.00cm。第二节分光光度法基本原理解设酶和AMP的浓度