蛋白质含量测定方法大全.pdf

《蛋白质含量测定方法大全.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、实验一蛋白质含量测定本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往

2、以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作

3、用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH

4、+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)NH22NH3+H2SO4→(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3(3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算

5、方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。五种蛋白质测定方法比较如下：方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法灵敏度低，费时将蛋白氮转化非蛋白氮用于标准蛋白(Kjedahl法适用于0.2~8-10为氨，用酸吸（可用三氯质含量的准确)1.0mg氮，误小时收后滴定乙酸沉淀蛋测定；干扰少；差为±2％白质而分费时太长离）双缩脲法灵敏度低中速多肽键＋碱性硫酸铵；用于快速测（Biuret法）1～20mg2

6、0~30Cu2＋→紫色Tris缓冲定，但不太灵分钟络合物液；某些氨敏；不同蛋白基酸质显色相似紫外吸收法较为灵敏快速蛋白质中的酪各种嘌吟和用于层析50～100μg5～10氨酸和色氨酸嘧啶；柱流出液的检分钟残基在280nm各种核苷酸测；核酸的吸处的光吸收收可以校正Folin－酚灵敏度高慢速双缩脲反硫酸铵；耗费时间长；试剂法～5μg40～应；磷钼酸－Tris缓冲操作要严格计（Lowry法）60分磷钨酸试剂被液；时；钟Tyr和Phe还原甘氨酸；颜色深浅随不各种硫醇同蛋白质变化考马斯亮蓝灵敏度最高快速考马斯亮蓝染强碱性

7、缓冲最好的方法；法1～5μg5～15料与蛋白质结液；干扰物质少；(Bradford分钟合时，其λmaxTritonX-颜色稳定；法)由465nm变为100;颜色深浅随不595nmSDS同蛋白质变化二、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。H2OO=CC=O

8、HNNHR-CHCH-RO=CCuC=OHNNHR-CHCH-RH2O紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋

9、白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NNaOH配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O