重组DNA技术与基因工程.ppt

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1、实验生物学重组DNA技术与基因工程华东理工大学张惠展重组DNA技术与基因工程523416重组DNA技术与基因工程的基本概念重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母中的表达A重组DNA技术与基因工程概念辨析1重组DNA技术与基因工程的基本概念重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、

2、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元重组DNA技术的定义件。A重组DNA技术与基因工程概念辨析1重组DNA技术与基因工程的基本概念基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞大规模培养、基因产物分离纯化、生物产品制造过程的工程化基因工程的定义（本讲座侧重于上游技术）。B重组DNA技术与基因工程的基本用途1重组DNA技术与基因工程的基本概念分离、扩增、鉴定、研究、整理基因信息资源规模

3、化生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种分离、扩增、鉴定、研究、整理基因信息资源从染色体DNA上定向分离目的基因将获得的目的基因扩增至足够数量采取加减法策略鉴定基因生物功能gainoffunctionlossoffunction通过序列缺失研究基因内的功能域根据同源基因序列整理生物进化树GGTATCGTCATCTACTACGTGGCAAT酶生物分子产品天然细胞天然细胞干细胞工程干细胞工程细胞组织器官分离工程组织工程组织器官生物分子产品发酵工程细胞工程代谢工程分离工程分离工程酶工程采集/培养基因工程蛋白质工程途径

4、工程组织工程基因工程规模化生产生物活性物质设计构建生物的新性状甚至新物种突变细胞基因敲除野生细胞野生动物基因敲除突变动物天然物质或合成物质高通量筛选基因导入基因导入C基因工程的基本形式1重组DNA技术与基因工程的基本概念第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构代谢途径工程第四代基因工程全基因组或染色体的操作基因组工程切接转增检第一代基因工程：蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代基因工程：突变蛋白和融合蛋白定制蛋白质工程天然蛋白质

5、编码序列蛋白质功能域编码序列突变蛋白融合蛋白第二代基因工程：全新蛋白设计蛋白质工程天然存在蛋白定向进化蛋白全新设计蛋白序列理论可能性20200种天然存在序列1012种Nature5372016PPPPPGDPGTPPPPPPPFGF质膜核膜FGFRFRSGrb2SOSRasRafMEKMAPKTFABCDEFG信号转导途径的遗传操作物质代谢途径的遗传操作单基因操作多基因操作强化表达/导入基因衰减表达/敲除基因定点突变/基因洗牌多单链片段重组多模件重组转录机器全局工程基因回路基因回路第三代基因工程：代谢信息途径的修饰重构途

6、径工程（合成生物学）第四代基因工程：基因组工程N.Annaluruetal.Science344,55,2014以野生型酿酒酵母第III号染色体的317kb序列为蓝本，作者设计并合成了一个273kb长的功能性染色体模仿物synIII。改造内容包括：终止密码子的置换；亚端粒区、内含子、tRNA基因、转座子、交配位点a的删除及96个loxP元件的插入。这条人工设计和改造的染色体对细胞生长无损害，且表现出多代遗传稳定性。J.C.Venteretal.Science351,1414,2016将化学合成的蕈状支原体基因组克隆在酵母

7、中，经甲基化修饰后移植到山羊支原体受体细胞中。第四代基因工程：全基因组的克隆与编辑基因组工程由此生成了一个基因组最小化的蕈状支原体化学合成型活性细胞JCVI-syn3.0，仅含473个基因，但生长速度降低两倍。第四代基因工程：基因组工程全基因组定点编辑基因组工程的另一项最新进展是利用CRISPR-Cas9系统在哺乳动物活细胞内对基因组上的各基因进行定向敲除，并由此建立起基因与表型之间的因果关联。在该系统中，细菌来源的核酸内切酶Cas9能在短小单链RNA（sgRNA）的指导下，序列特异性地定位并作用于复杂基因组上，从而实现

8、对哺乳动物大型基因组各区域的功能查询。T.Wangetal.Science343,80,2014；O.Shalemetal.Science343,84,2014D基因工程的基本原理1重组DNA技术与基因工程的基本概念提高外源基因的剂量：分子遗传学原理筛选修饰重组基因表达的转录调控元件：分子生物学原理如：启动子、增强子