细菌转化实验.ppt

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时间:2020-06-18

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1、实验一细菌质粒DNA的提取和纯化菌体pcr跟普通PCR原理是一样的,因为94度变形可以裂解细菌,释放出DNA,所以不用提质粒也可以PCR出来条带因为培养基含有水分,恒温培养时水分蒸发出来在培养皿盖上凝结,水滴落下来会冲坏菌落,不利于培养观察,所以需要倒置培养一、实验目的通过细菌质粒DNA的提取,掌握共价闭合环状DNA的提取方法。二、实验原理细菌中有两种DNA,即染色体DNA和质粒DNA。质粒DNA的提取方法有三种:碱裂解法、煮沸法和去污剂(如Triton和SDS)裂解法。碱裂解法比较剧烈,可破坏碱基配对,使宿主

2、细胞DNA变性,共价闭合环状DNA由于空间缠绕,两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时,质粒DNA的双链又迅速恢复原状,而较大的线性染色体DNA难以复性。三、实验菌株含质粒载体pGEM-T的大肠杆菌(E.coli.)四、实验用具和药品实验用具摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管(15mL)及塞子、离心管(1.5mL)。LB培养基配方:ddH2O950mL细菌培养用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g细菌培养用酵母提取物(bacto-yeastextract)5gNaCl10g琼脂粉(配制固体培

3、养基时需加入)15gNaOH调节pH至7.0(5mol/L约0.2mL),高压灭菌固体平板上添加氨苄青霉素实验药品溶液Ⅰ(高压灭菌):50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)溶液Ⅱ(现用现配):0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L的溶液稀释)1%SDS溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL五、实验步骤方法:活化-扩增-离心-裂解-离心-抽提-沉淀-洗涤-溶解(一)细菌繁殖实验前2天晚上:将冻存的菌株取出,划线

4、接种于LB(amp)平板上,置于37℃培养箱中,倒置培养至菌落长成。实验前1天晚上:从LB平板上挑取单个菌落,接种于6mlLB液体培养基(加入氨苄青霉素)中,37℃,过夜振荡(200r/min)培养。(二)菌体收集实验当天:将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管,5000r/min离心2min;弃上清(三)碱裂解法提取质粒DNA全套操作约需1小时,详细说明如下。3.加入250μl的SolutionⅠ(含RNaseA1)充分悬浮细菌沉淀。注)注意不要残留细小菌块,可以使用振荡器(Vortex)等剧烈振荡使菌体充分悬

5、浮。4.加入250μl的SolutionⅡ轻轻地上下翻转混合5~6次,使菌体充分裂解,形成透明溶液。注)此步骤不宜超过5分钟。5.加入400μl的4℃预冷的SolutionⅢ,轻轻上下翻转混合5~6次,直至形成紧实凝集块,然后室温静置2分钟。6.室温12,000rpm离心10分钟,取上清。注)此时4℃离心不利于沉淀沉降。7.将试剂盒中的SpinColumn(离心柱)安置于CollectionTube(收集管)上。8.将上述操作6的上清液转移至SpinColumn中,12,000rpm离心1分钟,弃滤液。9.将5

6、00μl的RinseA加入SpinColumn中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液。10.将700μl的Rinse(冲洗)B加入SpinColumn中,12,000rpm离心30秒钟,弃滤液。11.重复操作步骤10。12.将SpinColumn安置于CollectionTube上,12,000rpm离心1分钟。13.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上,在SpinColumn膜的中央处加入60μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer(洗脱缓冲液),室温静置1分钟。注)把灭菌蒸馏水或El

7、utionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率14.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。六、实验作业按上述实验步骤提取质粒DNA。思考本实验的关键步骤是什么?答:本实验的关键是溶液Ⅰ重悬须充分,溶液Ⅲ混合须温和。用bindingbuffer是为了增加洗脱柱对核酸的结合活性;washsolution是洗掉柱子里除核酸物质以外的杂质;而elutionbuffer就是最后把DNA从柱子上洗脱下来使用的溶液,一般是pH=8.0的TE,dd水也可以。实验二大肠杆菌的遗传转化一、实验目的通过实验了解原核生物

8、实现基因转移的途径,掌握质粒DNA遗传转化的基本原理和操作方法。二、实验原理转化(transformation)是指一种生物由于接受了另一种生物(或同种生物)的遗传物质,从而获得了后者的某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。用理化方法人工诱导细菌进入感受态的操作叫致敏过程。目前应用较广的转化方法有两种:CaCl2转化法(化学转化法)和电转化法。

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