免疫组化技术.ppt

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1、免疫组化技术北京神经科学研究所免疫组织化学（immunohistochemistry)又称免疫细胞化学（immunocytochemistry)是组织化学的分支，它是应用带有可见标记的特异性抗原-抗体反映，在原位检测组织和细胞的化学成分的一种技术。在基础研究领域应用：生物活性肽，酶和免疫球蛋白。临床应用：肿瘤的诊断和分型；自身免疫性疾病的检查，寄生虫等检测一基本概念二免疫学基础抗原(antigen)：凡能刺激机体发生特异性免疫应答的物质。抗原的两个基本性能：（1）免疫原性：是指抗原刺激机体产生抗体或效应淋巴细胞的性能，从而引起体液免

2、疫和细胞免疫。（2）免疫反应性：是指抗原与抗体或效应淋巴细胞发生特异性结合能力。完全抗原：既有免疫原性也有免疫反应性的抗原半抗原：或称不完全抗原，仅有免疫反应性的抗原(多糖，类脂多肽等）抗原性质：异物性，理化特性，特异性（抗原决定簇）抗体（AntibodyAb)：抗体是机体在抗原激活后，由B细胞分化的浆细胞产生的一类能与相应抗原结合的免疫球蛋白（immunoglobulin)共有IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五种。基本结构：IgM分子结构抗体的种类：有多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体Polyclonalantibody：用

3、含多种抗原决定基的抗原免疫动物，刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原决定基的不同抗体，为多克隆抗体，其免疫血清是含有多种抗体的混合物。特异性不高，易出现交叉反应单克隆抗体Monoclonalantibody：由一个B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞及其后代产生的一种高度均一、高度专一性的抗体，它只对一个抗原决定基发生反应，称单克隆抗体，其特异性强。三常用标记物1荧光染料：可以产生荧光的染料物质。其可吸收激发光的光能并发射出荧光。特点：A荧光色素具有吸收一定频率光能的生色团和能产生一定光量子的荧光团。B荧光素与抗原或抗体结合后，不破

4、坏抗原、抗体的免疫活性，制备成荧光标记的抗原或抗体与组织内的抗体或抗原结合形成不同颜色的激发荧光。C荧光存在的时间短，易猝灭，不利于观察和分析。种类1异硫氰酸荧光素（FITC):为黄色粉末或结晶，性质稳定，易溶于水和酒精。低温可保存多年，呈黄绿色荧光（490-495nm；520-530nm）2四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC):为紫色粉末，易溶于水。呈橙红色荧光（550nm，620nm）；3CY3(552nm,565nm2酶：酶是最常用的标记物，可用于光镜和电镜观察。酶作为标记物应具备的条件:1）酶催化的底物必须具有特异性，容易显示

5、（2）酶的性质稳定，不易扩散。（3）被检组织内不应存在内源性的酶或者其底物，若有应加酶的抑制剂，抑制内源性的酶（4）在酶标记过程中，酶与抗体连接不能影响二者的活性。常用的标记酶：辣根过氧化物酶（houseeradishperoxidaseHRP)硷性磷酸酶（alkalinephosphataseAKP)葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase)半乳糖苷酶（β–D-galactosidase)酶底物PH，温度有色产物过氧化物酶：底物是H2O2反应产生初级复合物，有电子供体存在时，产生还原型酶，释放氧，将电子供体氧化，产生有色终产物H

6、RPH2O2电子供体（DAB）PH=7.6，温度37°C有色产物有色产物硷性磷酸酶（AKP)：AKP使底物为萘酚磷酸盐中萘酚衍生物释放，并与固蓝（或者固红）结合形成兰色（红色）偶氮染料AKP萘酚磷酸盐固蓝BBPH=9.1，温度37°C兰色产物3生物素（biotin)：为水溶性维生素H，分子量小，通过其羧基与蛋白质的氨基结合,从而标记抗体和酶等，在肝肾、白细胞和蛋黄中含量丰富，是羧化酶和脱羧酶的辅酶，生物氧化的重要介质。特点：A与抗生物素之间以非共价键结合，作用快有极强的亲和力，结合牢固，一但结合很难解离。B抗体与生物素结合后抗原的活

7、性不受损失。抗生物素(avidin)：又称亲和素、卵白素，是鸡鸟等动物的输卵管分泌的一种碱性糖蛋白，蛋清含量丰富。抗生物素有4个亚单位。特点：A与4个生物素残基特异性结合，有极高的亲和力（1.5PH情况下解离）。B能与标记物结合。4金属标记物：主要有铁蛋白和胶体金，用于免疫电镜。组织制备常用的试剂配制常用缓冲液：ATris(三羟甲基氨基甲烷）缓冲液和Tris缓冲盐液（TB和TBS）B磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲盐液（PB和PBS）C醋酸缓冲液D0.1mol/l柠檬酸缓冲液2常用固定液：4%多聚甲醛0.1mol/lPB,PH:7.43黏附

8、剂；A明胶铬矾液（明胶：0.5g，铬矾0.05g加100ml水）B多聚赖氨酸4蛋白酶消化液：0.1%trypsin(可加氯化钙）：注意消化时间0.4%胃蛋白酶5H2O26去污剂tritonx-100浓度为0.1%-2.0%,溶于PBS