细菌转化,单克隆挑选及摇菌.doc

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1、细菌转化，单克隆挑选及摇菌1.接种50~100ul菌液于5mlLB试管中，37℃250转/分震荡约3小时，至OD600≈0.2-0.6时停止振荡（透过管能看到手指要挑选细菌活力强时）2、取1.5ml离心管与菌液放冰浴冷却15min3.将细菌转移至1.5mL的离心管中，4℃，4000转/分离心15min（防止菌体破裂），弃上清液4.以1ml0.1M（0.2倍菌液体积）预冷的CaCl2重悬细菌沉淀，冰浴30min，4℃，4000转/分离心15min，弃上清液5.用250μl（0.05倍菌液体积）预冷的CaCl2重悬细菌沉淀6.1ng质粒DNA加入到

2、感受态细菌中，轻轻旋转几次以混匀内容物，冰上放置30分钟7.将离心管放入42℃的循环水浴中，90秒8.将离心管置于冰上，10分钟9.加入200ulsoc培养基（加入了葡萄糖等物质，比LB培养基更营养，更利于热激后细菌恢复），200转37℃45min，同时将培养平板放入孵箱10.用一无菌玻璃推板轻轻将转化的细菌均匀地涂于培养基上。（玻璃推板充分火焰消毒，待充分冷却后再进行涂板，可将推板贴在平板盖内侧，再用手隔板盖感觉温度）11.37℃培养箱中正置平板，待液体完全干后再倒置平板，培养16小时，将平板取出4℃放置约2小时后观察。挑选单个肉眼能见菌落，

3、坐上在平板上做上标记（菌落不易太大，否则有杂菌混入，培养箱中培养不超过16个小时）12、在超净台内，将细菌挑入LB培养基，一个菌落一支管，180~200转/分钟过夜（12~16个小时，以菌体浑浊为佳）。抽取质粒（抽取质粒时每支LB管也应对应相应的EP管）备注LB培养基制备蛋白胨1%（g/ml）NaCl1%酵母粉0.5%到此配方为LB培养基（液体）若配制平板则加琼脂粉1.5%氨苄青霉素的储存浓度是50~100ug/ul，使用时稀释1000倍，以下步骤在超净台进行，培养液高压灭菌后，待容器不烫手时加入氨苄，轻摇混匀，倒入平板，每板大约20ml