细胞结构成本的离心分离技术.pdf

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1、1离心分离技术1.离心技术的基本概念2.离心机转头分类3.离心的基本方法4.细胞结构成分的离心分离方法2学习目标1.离心技术的基本概念；2.决定离心行为的两个因素和“三要素”；3.沉降系数、离心力和什么因素有关；4.离心的基本方法和适用范围；5.细胞结构成分的离心分离方法。3一.离心技术(Centrifuge)利用溶液中颗粒密度、大小等特性，用旋转产生的离心力使不同特性颗粒从溶液中分离并沉降，从而达到分离、浓缩、提纯和鉴定的目的，称为离心技术。*分离细胞或其他的悬浮颗粒；*从组织或细胞匀浆中分离细胞器；*分离病毒和大分子，包括DNA、RNA

2、、蛋白质和脂类。4什么是离心力？圆周运动的物体在旋转过程中产生的背向旋转轴的运动力。5决定离心行为的主要因素颗粒的属性：颗粒大小、密度等特性溶液和设备：离心机、离心介质6离心分离首先需要知道的“三要素”颗粒的沉降系数相对离心力离心时间71.沉降系数（S）：重要指标颗粒在单位离心力的作用下的移动速度dx/dt2r2(p-m)s（秒）==w2x9dx:颗粒与转轴中心的距离r:颗粒直径dt：颗粒沉降所需时间:颗粒密度pw:角速度:溶液介质密度mX:转子半径：溶液介质粘度S=1×10-13s8决定沉降速度的因素：颗粒大小；颗粒密度；溶液

3、介质密度和粘度92.相对离心力（RCF）：重要指标离心分离时，作用在悬浮颗粒上的力常用RCF数值表示，即同一颗粒在离心时的离心力同地球重力相比较后得到的值。RCF(g)=离心力/重力＝mw2x/mg=w2x/g＝1.12r(RPM/1000)2r:旋转中心轴至转头内离心管某一部位的半径RPM（roundsperminute，转速):转头旋转的次数103.离心时间颗粒经过溶液形成沉淀所需要的时间t=K/SK:表示转头离心效力的指标，与转速平方成反比。离心机公司提供最高转速时的K值。K值越小越好，效力越高。S：沉降系数离心时间由离心效力和沉降系

4、数决定11沉降离心中的两个因素RCF,tRCF×t=RCF×t1122例：沉降某颗粒需10000g·min10000g1min2000g5min12学习目标1.离心技术的基本概念2.离心机转头分类3.离心的基本方法4.细胞结构成分的离心分离方法13二.离心设备：离心机及离心管3.离心腔（真空设备）1.转头2.控制系统4.温度控制（马达）（冷却设备）14离心机分类低速：6800g(细胞级）常温、低温；分离>10000S的细胞及细胞器台式、立式；高速：17,700－50,400g（亚细胞级）分离>100S的颗粒，包括部低速、高速、超速分细胞器及

5、病毒超速：90,400－694,000g（分子级）离<100S的颗粒15转头损坏及原因转头不平衡离心管平衡误差；离心管放置不对称；水平转头吊桶盖安装不当；转头不加盖；O形密封圈失效金属疲劳超速化学腐蚀离心管帽、垫圈、接合器使用不当16学习目标1.离心技术的基本概念2.离心机转头分类3.离心的基本方法4.细胞结构成分的离心分离方法17三.离心方法1.差速离心法介质无密度梯度，颗粒大小有差异2.密度梯度离心法介质有密度梯度，颗粒密度有差异181.差速离心法(differentialcentrifugation)原理：通过一系列递增速度

6、的离心，依次将大小不同的颗粒逐级分离。上清上清上清上清颗粒混合物最大颗粒较大颗粒中等颗粒小颗粒19特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心，适用与大小差别较大的颗粒；操作简单，多次离心；分离纯度不高，需要确定离心力和离心时间。202.密度梯度离心法(densitygradientcentrifugation)离心介质有密度梯度s=2r2(-)pm921理想的离心介质可自行配制的：蔗糖商品化的：Ficoll,Percoll,Accudenz(Nycodenz)形成的溶液密度范围大粘度低对细胞成分损伤小离心分离后容易去除浓度容易测定价格

7、22密度梯度离心-移动区带离心法（moving-zonecentrifugation)原理：用梯度蔗糖或甘油作为介质，将要分离的样品放在介质表面，形成一个狭带，然后超速离心，使不同密度的颗粒以不同的速度向管底方向移动，形成一系列区带，从管底小孔中分次收集各种颗粒成分。23用途：分离有大小和密度差异的细胞或细胞器。特点：密度梯度介质，且密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度(>)。pm离心时间(t)，不能使所有颗粒都沉到管底。24密度梯度离心-等密度梯度离心法（isodensitycentrifugation)原理：离心时

8、采用包括各种颗粒密度范围的梯度介质，被分离颗粒达到与其相同的密度介质时不再移动，形成一系列区带，然后从管底收集。25用途：分离有密度差异的颗粒,适用于病毒、DNA、RNA、蛋白质