DB33T 2269-2020 猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR检测方法.pdf

《DB33T 2269-2020 猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR检测方法.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、ICS11.220B41DB33浙江省地方标准DB33/T2269—2020猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR检测方法DuplexfluorescencequantitativePCRmethodforthedetectionofporcinecircovirustype2andtype32020-06-30发布2020-07-30实施浙江省市场监督管理局发布DB33/T2269—2020前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机

2、构不承担识别这些专利的责任。本标准由浙江省农业农村厅提出。本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起草单位：浙江农林大学。本标准主要起草人：宋厚辉、邵春艳、周莹珊、王晓杜、孙静、姜胜、杨永春、程昌勇、章先、杨杨、卫芳芳。IDB33/T2269—2020猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR检测方法1范围本标准规定了猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR的检测方法。本标准适用于猪圆环病毒2型与3型的核酸检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件

3、，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值：达到阈值的循环数（Cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSolution）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）PCV-2：猪圆环病毒2型（PorcineCirco

4、virus2）PCV-3：猪圆环病毒3型（PorcineCircovirus3）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）4试剂和材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯；灭菌水，0.01mol/LPBS和8mmol/LNaOH配制中所使用的水应符合GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法中一级水的要求。4.1DNAzolReagent：DNA抽提试剂，2℃～8℃保存。4.2无水乙醇：4℃预冷。4.375%乙醇：用无水乙醇和灭菌水配制，-20℃预冷。4.48mmo

5、l/LNaOH溶液：配制方法见附录A。4.50.01mol/LPBS，pH7.2：配制方法见附录A。2+4.62×PremixHSTaq（内含PCRbuffer，HSTaq，dNTPs，Mg，RNaseH等）。4.7阳性对照：猪圆环病毒2型灭活疫苗和猪圆环病毒3型阳性克隆质粒。PCV-3目的基因（ORF2）序列见附录A。4.8空白对照：灭菌水。4.9用于荧光定量PCR的引物浓度为10µmol/L，Taqman探针浓度5µmol/L，其序列分别为：——PCV-2-F：5’-TCACCTATGACC

6、CCTATG-3’；1DB33/T2269—2020——PCV-2-R：5’-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3’；——PCV-2-P：5’-FAM-ACTCCTCTCGCCATACCATAACC-BHQ1-3’；——PCV-3-F：5’-TGGCTCAACACATATGAC-3’；——PCV-3-R：5’-ACGGACTTGTAACGAATC-3’；——PCV-3-P：5’-HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA-BHQ1-3’。4.10一次性耗材：乳胶手套、1.

7、5mL离心管、15mL离心管、荧光PCR反应管和吸头。5器材和设备5.1电热干燥箱。5.2高压灭菌锅。5.3高速台式冷冻离心机：可控温至4℃，最大离心速度可达12000r/min以上。5.4冷藏冰箱，超低温冰箱（-80℃）。5.5荧光PCR检测仪。5.6组织匀浆器。5.7移液器。5.8研钵。6实验室分区检测实验室应有相应的生物安全设施和功能分区，包括样品处理区、核酸提取区、试剂配制区和扩增区。各功能区有专用的试剂和实验材料，不可交叉使用。7样品的采集与处理7.1采样注意事项采样及样品前处理过程中

8、应注意无菌操作，防止样本交叉污染。7.2采样工具药匙、剪刀、镊子，经160℃干热灭菌2h。7.3采样方法与处理7.3.1内脏样品采取病死或剖杀猪的主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏和肾脏）装入15mL灭菌离心管中，按1：4倍体积加入灭菌的0.01mol/LPBS。运送至实验室后，再用研钵或组织匀浆器对组织进行充分研磨混匀，反复冻融3次。在4℃条件下以3000r/min离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用，待检。7.3.2血清样品血清样品无需处理，直接用于核酸提取。7.4存放与运送2D