DB33T 2268-2020 猫细小病毒PCR检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41DB33浙江省地方标准DB33/T2268—2020猫细小病毒PCR检测方法PCRdetectiontechniqueforfelinepanleukopeniavirus2020-06-30发布2020-07-30实施浙江省市场监督管理局发布DB33/T2268—2020前言本标准按照GB/T1.1—2009的规定编写。本标准由浙江省农业农村厅提出。本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：张红丽、徐辉、赵灵燕、周彩琴、吴贇竑、黄靖、吕见涛、刘爱军

2、、刘霞、吴雪军、孙冰冰、章杭建。IDB33/T2268—2020猫细小病毒PCR检测方法1范围本标准规定了猫细小病毒PCR（polymerasechainreaction）的实验条件、操作步骤、结果判定。本标准适用于猫细小病毒（猫泛白细胞减少症病毒）的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1猫细小病毒Felinepan

3、leukopeniavirus，FPLV属细小病毒科，细小病毒亚科，牛犬细小病毒属成员，又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性胃肠炎病毒或猫瘟病毒。4实验条件4.1试剂4.1.1要求除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，水为符合GB/T6682要求的灭菌双蒸水或超纯水。4.1.2试剂4.1.2.1核糖核酸酶（20mg/mL）。4.1.2.210%十二烷基磺酸钠溶液。4.1.2.310mg/mL蛋白酶K。4.1.2.4Tris-盐酸饱和酚（pH7.6）。4.1.2.5酚-氯仿-异戊醇混合液（25：24：1）：在一灭菌棕色瓶中按25：24：1比例

4、分别加入酚、氯仿、异戊醇。4.1.2.63mol/L乙酸钠（pH5.4）。4.1.2.7琼脂糖。1DB33/T2268—20204.1.2.810μg/μL溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）：溴化乙锭20mg、加灭菌双蒸水至20mL充分溶解混匀而成。4.1.2.950×TAE缓冲液：羟基甲基氨基甲烷（Tris）242g、冰乙酸57.1mL、0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）100mL，加灭菌双蒸水至1000mL充分混匀。4.1.2.10加样缓冲液：聚蔗糖25g、溴酚蓝0.1g、二甲苯青0.1g，加灭菌双蒸水至10

5、0mL充分溶解混匀而成。4.1.2.112.5mmoldNTPs（deoxyribonucleosidetriphosphates，脱氧核糖核苷三磷酸）。4.1.2.1210×PCRBuffer。4.1.2.13DNA分子量标准：DL2000。4.1.2.14引物序列FPLV-F：5'—CCAGCTGAGGTTGGTTATAGTG—3'；FPLV-R：5'—GGTGCATTTACATGAAGTCTTGG—3'。4.2仪器设备4.2.1高速冷冻离心机：要求最大离心力在12000rpm以上。4.2.2PCR扩增仪。4.2.3核酸电泳仪和水平电泳

6、槽。4.2.4微波炉。4.2.5分析天平。4.2.6恒温水浴锅。4.2.7冷藏冰箱和低温冷冻冰箱。4.2.8微量移液器。4.2.9凝胶成像系统（或紫外透射仪）。4.2.10高压灭菌锅。4.2.11超净工作台或生物安全柜。5操作步骤5.1样品的采集和处理5.1.1采集动物粪便、肛拭子、全血或肠道等组织样品并进行处理:a)肛拭子、粪便（加适量PBS）等样品经4℃5000rpm/min离心2min，取上清液；b)全血样品待血凝后经5000rpm/min离心2min，取血清；c)取0.1g肠道等样品与灭菌PBS（全称、浓度）按1：5的重量体积比制成悬

7、液，匀浆后，反复冻融3次，在涡旋混合器上混匀后经4℃5000rpm/min离心10min，取上清液。5.1.2制备的样品在2℃～8℃保存时间不应超过24h，长期保存应分装成小管，置于-20℃以下，避免反复冻融。5.2DNA的提取5.2.1设立阳性、阴性样品对照，阳性对照为猫细小病毒阳性样品，阴性对照为灭菌双蒸水。5.2.2按下列步骤完成DNA的提取，也可选择市售商品化DNA提取试剂盒，完成DNA的提取：a)取1.5mL灭菌离心管，加入处理样品5.1.1上清液400µL和30µL（20mg/mL）核糖核酸酶，混匀后，室温下作用20min；2DB

8、33/T2268—2020b)加入43µL10%的十二烷基磺酸钠溶液和5µL蛋白酶K，42℃水浴温育过夜（或55℃30min以上）；c)加入等量的Tris-盐酸饱和