合工大生化实验方案.doc

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1、不同植物样品可溶性蛋白含量和多肽组分的差异一．实验目的与意义1.掌握冷冻离心机的操作使用方法。2.掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理。3.掌握分光光度计的使用方法和原理。4.掌握可溶性蛋白的定量测定方法和原理。5.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和基本操作过程。二．试剂与仪器试剂：Tris[60g]，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）[5g]，β-巯基乙醇[2.5ml]，蛋白酶抑止剂（PMSF苯甲基磺酸氟）；100μg／mL牛血清白蛋白（125mg），考马斯亮蓝G-250（500mg），90％乙醇（250mL），85％（W／V）的磷酸（500mL）；Na2HPO4·12H2O（250g）

2、，NaH2PO4·2H2O（50g），SDS（500mg），巯基乙醇（0.5ml），甘油（5ml），溴酚蓝（10mg），0.2mol/LpH磷酸盐缓冲液（3L），Acr（150g），Bis（10g），TEMED（10ml），AP（50g），冰乙酸（350ml），甲醇（250ml），50%甲醇（2L），冰乙酸（200ml），仪器：研体，烧杯，玻璃棒，量筒（10ml），移液管，1000ml容量瓶,冰浴，离心机；分光光度计，烧杯，量筒，移液管，试管（8个），100mL容量瓶（2个），1000mL容量瓶（4个），棕色瓶，夹心式垂直板电泳槽（附带凝胶模135×100×1.5mm，1台/组

3、），直流稳压电源（电压300—600V，电流50—100mA），，微量注射器（10或50μL），大培养皿（φ120—160mm1个），棕色瓶（4个），三．实验材料马铃薯根茎叶四．试验方法与操作过程不同植物样品可溶性蛋白的提取设备：研体，烧杯，玻璃棒，量筒（10ml），移液管，1000ml容量瓶,冰浴；试剂：1.提取缓冲液：（0.0125mol的Tris-Hcl，pH7.0），称取12.5gTris于烧杯，用适量双蒸馏水溶解，HCL调PH至7.0，定容至1000Ml.2.聚乙烯吡咯烷酮（PVP）[5g]3.β-巯基乙醇[2.5ml]4..蛋白酶抑止剂（PMSF苯甲基磺酸氟）操作步

4、骤：1.将买来的新鲜马铃薯整株清洗干净，分别剪取马铃薯的根茎叶。分别准确称取3g植物材料于研钵中，加入10ml预冷的提取缓冲液（Tris缓冲液，Ph7.0），1g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和0.5ml的β-巯基乙醇，可加入蛋白酶抑止剂（PMSF苯甲基磺酸氟），置冰浴研磨匀浆，至20分钟。2、将研磨匀浆转移到塑料离心管并编号，提取液总体积10ml左右。先在4500r/min下离心20min，倾出上清液，并测定溶液体积，然后在10000r／min条件下离心10分钟，用吸管吸取上清液，至容量瓶中，定容至l00ml，并贴上标签。此即为植物不同样品中可溶性蛋白的提取液。可溶性蛋白含量的测定

5、仪器：分光光度计，烧杯，量筒，移液管，试管（8个），100mL容量瓶，1000mL容量瓶，棕色瓶，试剂：1．标准蛋白质溶液（100μg／mL牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL即可。2．考马斯亮蓝试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入100mL85％（W／V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。操作步骤1、标准曲线的绘制。取6支试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对

6、照，利用分光光度计在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。2、样品测定分别从三种蛋白提取液中测定其中所含蛋白的含量，因此，分别吸取先前提取的可溶性蛋白提取液1ml，加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得每种提取液中的蛋白质含量。试管编号0123451mg/L标准蛋白溶液/ml蒸馏水—1.00.20.80.40.60.60.40.80.21.00考马斯亮蓝5.05.05.05.05.05.0标准蛋白浓度(ug/ml)020406080100A595nm聚丙烯凝胶电泳分离可溶性蛋白试

7、剂1.连续体系SDS—PAGE有关试剂1）0.2mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液：称Na2HPO4·12H2O51.58g及NaH2PO4·2H2O8.74g，溶于重蒸水中并定容1L。2)样品溶解液（上样液）：10ml/组01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS、1%巯基乙醇、10%甘油和0.02%溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测蛋白质样品。配制方法见表3-2：SDS巯基乙醇甘油溴酚蓝0.2mol/LpH磷酸盐缓冲液加重蒸水至最后总体积为100mg0.1ml1ml2mg0.5ml