行业标准：LY∕T 3107-2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程.pdf

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1、ICS65.020.20B61LY中华人民共和国林业行业标准LY/T3107—2019柳树品种微卫星标记鉴别技术规程TechnicalregulationforwillowvarietiesidentificationbySSRmarkers（发布稿）2019-10-23发布2020-04-01实施国家林业和草原局发布LY/T3107—2019前言本标准按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。本标准由全国林木种子标准化技术委员会（SAC/TC115）提出并归口。本标准主要起草单位：南京林业大学。本标准参加起草单位：江苏省林业科学研究院；山

2、东省林业科学研究院。本标准主要起草人：李淑娴、戴晓港、尹佟明、陈赢男、刘德玺、何旭东。ILY/T3107—2019柳树品种微卫星标记鉴别技术规程范围本标准规定了以柳属(Salix)植物DNA为材料，利用微卫星标记(microsatellite)对国家和省审(认)定的柳树品种进行分子鉴定的规范化操作技术。本标准适用于附录A中所列柳树品种的鉴别。2术语和定义2.1微卫星标记microsatellite微卫星标记，又被称为短串联重复序列(shorttandemrepeats,STRs)或简单重复序列(simplesequencerepeats，简称SSR)，是指基因组中由2～6个核苷酸组成的

3、DNA串联重复序列。2.2基因型频率genotypefrequency基因型频率指不同基因型在全部个体中所占的比率，全部基因型频率的总和为1或100%。3操作程序3.1取样和保存取柳树幼嫩叶片5片～10片，用干燥硅胶密封保存，用于DNA提取。3.2DNA提取所需试剂a)1MTris：称取12.11gTris溶解到80mL超纯水中，调节pH=8.0，定容到100mL。b)0.5MEDTA：称取18.61gEDTA溶解到80mL超纯水中，调节pH=8.0，定容到100mL。c)5M氯化钠：称取23.38g氯化钠溶解到80mL超纯水中，定容到100mL。d)5M醋酸钾：称取25.54g醋酸钾

4、，200mL超纯水溶解后定容到250mL。e)2%SDS：称取1.0g十二烷基硫酸钠(SDS)，40mL超纯水溶解后定容到50mL。f)10%CTAB：称取10gCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶解到80mL超纯水中，定容到100mL。g)氯仿异戊醇：240mL氯仿，10mL异戊醇混合。h)70%乙醇：70mL乙醇，加入30mL超纯水。i)CTAB裂解液：1mL1MTris(pH=8.0)，4mL0.5MEDTA(pH=8.0)，28mL5M氯化钠，10mL10%CTAB，5g聚乙烯吡咯烷酮，定容到100mL。j)TBE缓冲液(10×)：称取108gTris碱和55g硼酸，加入40mL

5、0.5MEDTA溶液（pH=8.0），用1LY/T3107—2019800mL双蒸水溶解后定容到1L，高温灭菌。3.3DNA提取DNA提取采用改良的CTAB法：a)向2mL离心管中加入400µLCTAB裂解液，10µL的10mg/mLRnase，2µLβ-巯基乙醇。b)取柳树叶片3-5片，放入研钵中加入液氮充分研磨，将研磨后的样品转入3.2.1的离心管中，涡旋混匀后，65℃保温10min，再加入400µL2%SDS，涡旋混匀，65℃保温10min。c)向3.2.2的离心管中加入130µL5M醋酸钾，涡旋混匀，将离心管插入冰中保存10min。d)加入800µL氯仿异戊醇溶液(氯仿:异戊醇

6、=24:1)，涡旋混匀后，12000rpm离心5min。e)将上清液转移到新的2mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管8-10次，-20℃冻存20min。f)取出离心管，12000rpm离心5min，去除上清液。g)加入500µL的70%乙醇，12000rpm离心2min，去除上清液。h)重复3.2.7步骤一次。i)加入500µL无水乙醇，12000rpm离心5min，去除上清液，离心管开盖室温放置30min。j)加入100µLTE缓冲液，37℃保存5min，涡旋混匀获得DNA，将样品放在-80℃长期保存。3.4DNA定量及质量检测a)取2µLDNA用微量核酸蛋白检测仪检测，

7、直接读出DNA浓度和A260/280的比值。b)根据上述测定浓度，取200ngDNA，加入2µL溴酚蓝，在1%的琼脂糖凝胶上电泳，加入5000bpmarker作对照，稳压100V，电泳缓冲液为1×TBE，电泳结束后用凝胶成像系统记录拍照。c)根据微量核酸蛋白检测仪的定量结果，将样品稀释成20ng/µL，在-20℃下保存备用。3.5目的片段PCR扩增3.5.116对SSR引物及序列见附录B。3.5.2目的片段扩增反应体系为15µL，具体试剂用量见