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1、免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时4,1XPBS清洗玻片，3X5min从此请保持玻片湿润5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时
2、在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5）6，室温封闭1小时封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白7，一抗4℃过夜请用封闭液稀释一抗8,第二天Wash,1XPBS,2x1min9,二抗，1:1000（alexa系列）1:300（dyelight)in封闭液，避光室温1小时10,Wash,1X
3、PBS,3x5min11,DAPI染核5min，12，DDWRinse13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14，干片后4℃保存石蜡切片的免疫荧光1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min-xylene2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min-70%EtoH10min-，DDW5min4,Rinse玻片1xPBS,从此请保持玻片湿润5，抗原修复过夜。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压
4、修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5）6，室温封闭1小时封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白7，一抗4℃过夜请用封闭液稀释一抗，如果没有二抗种属来源的正常血清，细胞因子用1%BSA封闭，同时一定要有一个阴性对照。8,第二天Wa
5、sh,1XPBS,2x1min9,二抗，1:1000（alexa系列）1:300（Dyelight)in封闭液，避光室温1小时10,Wash,1XPBS,3x5min11,DDWRinse,DAPI染核5min，12，DDWRinse13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14，干片后4℃保存备注：多重荧光染色原则A:尽量选择不同种属来源的一抗：可同时染B:如果种属来源相同的一抗：可顺次染色，抗原修复:O/N第一个一抗：4℃O/N,第二天对应二抗@RT1hr红光短暂地封闭第二个一抗：@RT2hr，对应二抗@RT1hr绿光：DAPI封片备注：对照实验A:
6、阴性对照：组织免疫荧光必做相同标本：只加荧光二抗:排除非特异性染色不同样本：采用确定不含一抗对应抗原的标本验证荧光信号的特异性B：阳性对照：采用确定含有一抗对应抗原的标本TUNEL与免疫荧光共染时细胞的免疫荧光1，细胞生长贴壁到80%融合，倒掉细胞培养液2，Rinse，用固定剂rinse一到两次3，首选4%多聚甲醛固定15min，0.2%TritonX-100打孔5-10min；或者选用不同的固定方式：甲醇（分析纯orHPLC)-20℃10min丙酮（HPLC）-20℃10min4%多聚甲醛+0.2%TritonX-10010min4%多聚甲醛+0.2%Sapo
7、nins10min细胞核核膜4%多聚甲醛15min+-20℃甲醇5min细胞膜4%多聚甲醛15min+-20℃丙酮5min细胞骨架/微管蛋白4%多聚甲醛10min@RT+4℃10min+-20℃甲醇1min细胞膜+胞浆蛋白+细胞核4,Wash,1xPBS,2x1min从此请保持细胞湿润5,室温封闭1小时封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in1xPBS6，一抗4℃过夜请用封闭液稀释一抗7,第二天Wash,1XPBS,2x1min8,二抗，1:1000（alexa系列）1:300（Dyel
8、ight)in封闭液，避
