核酸检测基本知识.doc

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1、核酸检测基本知识1.什么是核酸检测核酸的定义：核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。核酸具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息和传递遗传信息。2.核酸的分类核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。3.核酸的组成DNA和RNA都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的，由C、H、O、N、P，5种元素组成。DNA是绝大多数生物的遗传物质，RNA是少数不含DNA的病毒（如HIV病毒，流感病毒，SARS病毒等）的遗传物质。RNA平均长度大约为2000个核苷酸，而人

2、的DNA却是很长的，约有3X10^9个核苷酸。4.核酸的功能在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。DNA与RNA都是核酸，它们在化学组成上有什么区别如下：DNA与RNA的比较DNARNA主要存在部位细胞核细胞质基本组成单位脱氧核苷酸核糖核苷酸碱基种类A、G、C、TA、G、C、U五碳糖种类脱氧核糖核糖核苷酸链两条脱氧核苷酸链一条核糖核苷酸链5.检测方法核酸检测方法，主要通过同时进行靶核酸扩增和可检测信号的生成

3、来检测样品中的靶核酸。可应用于临床微生物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域的核酸检测。目前主要使用的方法有以下几种：a.核酸序列依赖性扩增法NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在42℃进行,可在2h内将RNA模板扩增约109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物I与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA杂合体,随即RNaseH降解RNA,引

4、物Ⅱ与cDNA退火,在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相,对模板进行大量扩增。b.转录介导的扩增技术TMA技术原理与NASBA基本一致，略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性。反应在41.5℃进行,可在1h内将RNA模板扩增约109倍。c.连接酶酶促链式反应(LCR)LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种探针扩增技术，

5、是继PCR后新发展的一种较有前景的体外扩增技术。它的原理就是由2段寡核苷酸单链DNA探针与目标序列杂交,当该2段DNA探针与没有发生突变的模板褪火后,如果2探针是紧邻的,中间没有核苷酸间隔,则可在连接酶作用下连接起来,连接以后的新链又可以作为模板,引导下一周期的连接产生新的子链。若连接区段发生核苷酸的碱基突变,则连接反应不能发生,扩增反应终止。d.多聚酶链反应检测法(PCR)PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。①模板DNA的变性：模板DNA

6、经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。③引物的延伸：DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成1条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性—退火—延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成1个循环需

7、2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。检测HIVRNA,需要先利用逆转录反应将RNA转录为cDNA，继而以cDNA为模板进行PCR扩增即可，这样的反应称为RT-PCR。e.实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。本技术的原理是使用荧光基团标记探针,5′端标记荧光基团R,3′端标记淬灭基团Q,在没有PCR扩增时,由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近,使荧光基团被淬灭,不发荧光;而当PCR扩增时,引物与荧

8、光标记的特异性探针同时结合在模板上,荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间,利用Taq酶的5′3′外切酶活性,将荧光探针水解,荧光基团被释放出来,由于在空